雙峰駝源纖維素降解菌的篩選及其對酒糟的降解效果

李國偉, 何靜, 郭坤杰, 吉日木圖,2*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 呼和浩特 010018; 2.內(nèi)蒙古駱駝研究院, 內(nèi)蒙古 巴丹吉林 737300)

駱駝作為荒漠、半荒漠地區(qū)的主要畜種，既是農(nóng)牧民重要的生活伙伴，又是重要的生產(chǎn)伙伴，其獨(dú)特的役用性能在邊陲地區(qū)交通運(yùn)輸中發(fā)揮著特殊的功能，被冠以“沙漠之舟”之稱。我國養(yǎng)駝歷史悠久，長期的自然選擇使駱駝具有貼合荒漠地區(qū)自然生態(tài)條件的生理功能。通過對駱駝腸道微生物的多樣性分析，確定駱駝腸道微生物有很好的纖維素降解能力，纖維素降解菌高度富集[1-4]。草食動(dòng)物的胃腸道中寄生著具有降解纖維素能力的菌群，從中分離篩選得到的纖維素降解菌具有較為獨(dú)特的生理特性，目前已經(jīng)在奶牛[5-6]和野生草食性動(dòng)物如梅花鹿[7-8]、大象、袋鼠和羊駝[9-10]等動(dòng)物中展開研究。雙峰駝作為我國邊陲地區(qū)的主要畜種，對其腸道中高效纖維素降解菌的研究已經(jīng)成為駱駝科學(xué)研究的重要組成部分之一，可以為提高雙峰駝的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，繁榮邊區(qū)經(jīng)濟(jì)，促進(jìn)邊區(qū)的安定團(tuán)結(jié)發(fā)揮重要作用。

白酒為中國特有的一種蒸餾酒，是世界六大蒸餾酒之一，我國每年會因?yàn)獒勗彀拙贫a(chǎn)生大量的白酒糟。白酒糟是谷物發(fā)酵成白酒過程中的原料殘余物，其營養(yǎng)價(jià)值十分豐富，主要包括蛋白質(zhì)、脂肪、纖維素、鈣、磷等營養(yǎng)物質(zhì)，并富含發(fā)酵產(chǎn)物，如酵母和活性因子等[11-12]。白酒糟中含有豐富的粗蛋白，含量可達(dá)25%左右，將其當(dāng)做動(dòng)物飼料是一個(gè)很好的選擇，但是由于其在動(dòng)物體內(nèi)的消化率低而沒有得到廣泛應(yīng)用[13]。近年來，在酒糟中適量添加纖維素降解菌，不僅可以豐富飼料的來源、還能提高飼料的品質(zhì)、改善酒糟在動(dòng)物體內(nèi)消化率低的問題，同時(shí)還能豐富動(dòng)物體內(nèi)的同源酶類、降低抗?fàn)I養(yǎng)因子。但大部分篩選得到的纖維素降解菌在生產(chǎn)上具有很大的局限性，如發(fā)酵周期長、菌株耐受性差、纖維素酶活力低等，暫不能應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中，所以篩選高效的具有特殊酶活性的纖維素降解菌是今后的工作重點(diǎn)。本研究從具有特殊生物學(xué)特性的雙峰駝糞便中分離篩選能夠高效降解纖維素的菌株，并對分離得到的菌株進(jìn)行鑒定和產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，探究分離得到的菌株對酒糟中纖維素的降解能力，為酒糟的微生物發(fā)酵提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料來源

于內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市烏拉特后旗牧場隨機(jī)采集10峰成年雙峰駝的新鮮糞便。

白酒糟由內(nèi)蒙古河套酒廠提供。

1.2 培養(yǎng)基和溶液

1.2.1富集培養(yǎng)基羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)10 g、酵母膏粉1 g、硫酸銨1 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5 g、氯化鈉0.5 g、七水合硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)0.1 g，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2。

1.2.2涂布劃線培養(yǎng)基CMC-Na 5 g、硫酸銨1 g、磷酸二氫鉀1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、氯化鈉0.5 g、FeSO4·7H2O 0.1 g、瓊脂15 g，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2。

1.2.3纖維素剛果紅瓊脂培養(yǎng)基CMC-Na 5 g、硫酸銨1 g、磷酸二氫鉀1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、氯化鈉0.5 g、剛果紅0.2 g、FeSO4·7H2O 0.1 g、瓊脂15 g，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2。

1.2.4發(fā)酵培養(yǎng)基CMC-Na 10 g、蛋白胨3 g、硫酸銨1 g、磷酸二氫鉀1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、氯化鈉0.5 g、FeSO4·7H2O 0.1 g，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2。

1.2.5LB液體培養(yǎng)基蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、酵母膏粉5 g、葡萄糖1 g，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2。

1.2.63,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑的配制 稱取酒石酸鉀鈉182.0 g，3,5-二硝基水楊酸6.3 g，加熱溶解。取1 000 mL燒杯，稱取21 g氫氧化鈉、苯酚5.0 g、無水亞硫酸鈉5.0 g，均勻加熱并用玻璃棒攪拌至完全溶解，然后將兩種溶液混合，冷卻后用蒸餾水定容至1 000 mL，然后把溶液移至棕色試劑瓶中，室溫避光保存，放置一周至溶液性質(zhì)穩(wěn)定后備用[7]。

1.2.7檸檬酸緩沖溶液(pH 4.8) A液：稱取檸檬酸21.014 g用蒸餾水溶解后定容至1 000 mL。B液：稱取29.41 g檸檬酸鈉用蒸餾水溶解后定容至1 000 mL。取230 mL A液和270 mL B液，定容至500 mL即為檸檬酸緩沖液[14]。

1.2.81% CMC-Na溶液 CMC-Na 10 g，檸檬酸緩沖液(pH=4.8)1 L。

1.3 纖維素降解菌的篩選

準(zhǔn)確稱取新鮮雙峰駝糞便樣品10 g，放入裝有90 mL富集培養(yǎng)基的250 mL三角瓶內(nèi)，并放入一定量的玻璃珠，在37 ℃、180 r·min-1THZ-98C恒溫震蕩培養(yǎng)箱(上海一恒)中培養(yǎng)3 d。將培養(yǎng)后的菌液稀釋10倍，各吸取稀釋度為10-3～10-6倍的菌液100 μL涂于涂布劃線培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行，倒置放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。之后挑選單菌落用牛津杯法[15]接種于纖維素剛果紅瓊脂培養(yǎng)基中，倒置放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，測定相應(yīng)透明圈直徑(D)和纖維素酶活力。將水解圈的直徑和菌落直徑(d)比值(D/d)較大的菌落在劃線培養(yǎng)基上連續(xù)劃線，直至得到純菌落[16]。

1.4 酶活的測定

將解凍的菌液接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r·min-1恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)24 h。然后將培養(yǎng)后的菌液離心去除菌體，取上清即得粗酶液。以葡萄糖濃度作為標(biāo)準(zhǔn)[16]，采用DNS試劑法測定纖維素酶活力。

CMCase活力的測定：參照韋海婷[7]方法并稍作改動(dòng)。調(diào)整待測粗酶液和DNS顯色液的添加量為0.5和1.5 mL。酶活力單位(IU)定義為：1 mL酶液1 min產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需酶量為1個(gè)酶活單位。計(jì)算公式如下。

(1)

式中，A為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的葡萄糖含量(mg·mL-1)；v為反應(yīng)液總體積(mL)；M為葡萄糖摩爾質(zhì)量(180.2 g·mol-1)；V為反應(yīng)中加入的粗酶液體積(mL)；T為反應(yīng)時(shí)間(min)。

FPase活力測定：參照韋海婷[7]方法并稍作改動(dòng)。調(diào)整待測粗酶液和DNS顯色液的添加量為0.5和1.5 mL。FPase酶活計(jì)算公式參照式(1)。

1.5 纖維素降解菌的鑒定

1.5.1形態(tài)學(xué)觀察將復(fù)篩純化后的菌株在培養(yǎng)平板上劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h觀察菌落特征，然后對菌株進(jìn)行革蘭氏染色觀察。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[17]，使用青島海博生物技術(shù)有限公司的生理生化鑒定管進(jìn)行靛基質(zhì)試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、西蒙氏枸櫞酸鹽試驗(yàn)、明膠試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、過氧化氫接觸酶試驗(yàn)以及碳源同化試驗(yàn)在內(nèi)的生理生化試驗(yàn)。

1.5.2分子生物學(xué)鑒定將復(fù)篩后的菌株送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行16S rRNA測序，將獲得的DNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對分析，在LPSN上選取同源性較高的模式菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，借助MEGA 7.0軟件分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定所選菌株的同源性。

1.6 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

1.6.1最適接種量的確定分別按1%、2%、3%、4%、5%、6%接種量將種子液接種至裝有50 mL、初始pH 7的發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，在37 ℃、180 r·min-1恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，測定CMCase和FPase活力。

1.6.2最適初始pH的確定將種子液以2%的接種量接種至裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，調(diào)節(jié)初始pH為2、3、4、5、6、7、8、9，在37 ℃、180 r·min-1恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，測定CMCase和FPase活力。

1.6.3最適培養(yǎng)溫度的確定將種子液以2%的接種量接種至裝有50 mL、初始pH 7的發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，在溫度為25、30、35、40、45 ℃，180 r·min-1恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，測定CMCase和FPase活力。

1.6.4最適發(fā)酵時(shí)間的確定將種子液以2%的接種量接種至裝有50 mL，初始pH 7的發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，37 ℃、180 r·min-1恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔6 h測定一次CMCase和FPase活力，總共培養(yǎng)96 h。

1.6.5響應(yīng)面試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取接種量、初始pH、培養(yǎng)溫度、發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素，以CMCase活力為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以確定最適產(chǎn)酶條件。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Coding level of response surface design factors

1.7 對酒糟中纖維素的降解能力檢測

將酒糟烘干后粉碎，過40目篩備用。根據(jù)前期篩選的最適產(chǎn)酶條件對YT5-1-1進(jìn)行優(yōu)化，將優(yōu)化后的YT5-1-1以10%的接種量接種于經(jīng)過預(yù)處理的干酒糟中，控制含水量為55%，發(fā)酵周期為21 d，分別在第7、14和21 d取樣[18]。取發(fā)酵酒糟樣品10 g，加入90 mL蒸餾水，充分?jǐn)嚢韬笾苯訙ypH值。參照GB 6435-2014[19]，將發(fā)酵酒糟樣品在65 ℃烘干后稱重，計(jì)算干物質(zhì)含量。采用范式(Van Soest)法[20]，使用ANKOM 200i半自動(dòng)纖維分析儀纖維素分析儀(美國，Ankom)測定中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量，均3次重復(fù)。在待測定的酸性洗滌纖維樣品中加入足量72%硫酸浸泡，開始時(shí)攪拌濾袋，使濾袋與硫酸充分接觸。3 h后將硫酸倒掉，并用熱水洗滌至中性，然后用丙酮淋洗3 min。105 ℃烘箱內(nèi)干燥3 h左右，然后置于干燥器內(nèi)冷卻至室溫，稱重。消化過程中溶解部分為纖維素，不溶解的殘?jiān)鼮樗嵝韵礈炷举|(zhì)素和酸不溶灰分。根據(jù)以下公式[21]計(jì)算半纖維素含量(hemicellulose，HC)、半纖維素降解率(degradation rate of hemicellulose，D-HC)、纖維素含量(cellulose，CL)和纖維素降解率(degradation rate of cellulose，D-CL)。

HC=NDF-ADF

(2)

(3)

CL=ADF-經(jīng)72%硫酸處理后的殘?jiān)?/p>

(4)

(5)

式中，HC1為降解前的半纖維素含量，HC2為降解后的半纖維素含量，CL1為降解前的纖維素含量，CL2為降解后纖維素的含量。

根據(jù)以上公式測得酒糟樣品的原始pH為4.0，NDF為51.05%，ADF為35.73%，D-HC 為15.32%，D-CL為35.06%。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)處理用Microsoft Excel 2016初步處理后，利用GraphPad Prism·6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的差異性分析和圖表繪制，并借助Design Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以還原性糖含量為自變量，對應(yīng)的吸光度(OD)值為因變量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果(圖1)可知，繪制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為：y=0.337 3x+0.015 3，R2為0.999 3，R2>0.99，說明該標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性高，相關(guān)性好。方程中的0.015 3為補(bǔ)償參數(shù)。根據(jù)此方程，可用待測溶液的吸光度值計(jì)算出對應(yīng)的葡萄糖含量。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 纖維素降解菌的篩選結(jié)果

通過3次富集，從雙峰駝糞便內(nèi)容物中共篩選出21株能夠降解纖維素的菌株，這些菌株的透明圈與菌落直徑的比值(D/d)以及CMCase和FPase活力結(jié)果(表2)顯示，菌株YT5-1-1的D/d值為2.1，CMCase活力為(0.580±0.008)IU·mL-1，F(xiàn)Pase活力為(0.820±0.025) IU·mL-1。綜合來看，YT5-1-1菌株的纖維素降解能力較強(qiáng)。纖維素降解菌將纖維素剛果紅瓊脂培養(yǎng)基中的纖維素降解成小分子糖，因?yàn)閯偣t無法與小分子糖結(jié)合而被洗脫掉，呈現(xiàn)透明圈。因此,菌株YT5-1-1在纖維素剛果紅瓊脂培養(yǎng)基的生長結(jié)果(圖2)也反映了該菌株具有很強(qiáng)的纖維素降解能力。

表2 纖維素降解菌的D/d值和纖維素酶活力Table 2 D/d value and cellulase activity of cellulolytic bacteria

2.3 雙峰駝糞便中纖維素降解菌的鑒定

2.3.1形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果篩選得到的菌株YT5-1-1的形態(tài)學(xué)結(jié)果見圖3，可見，菌株YT5-1-1的菌落呈白色，圓形，表面光滑濕潤，革蘭氏染色為陰性，在顯微鏡下觀察為直桿菌，無芽孢。其生理生化特性檢測結(jié)果(表3)顯示，該菌株的靛基質(zhì)試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、西蒙氏枸櫞酸鹽試驗(yàn)、過氧化氫接觸酶試驗(yàn)結(jié)果為陽性，說明菌株能產(chǎn)生吲哚，將葡萄糖分解成丙酮酸后脫羧，形成酮醇類的中性物質(zhì)，能利用檸檬酸鹽作為唯一的碳源，并且菌株中含有過氧化氫酶。MR試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、明膠試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)結(jié)果為陰性，說明菌株將普通糖分解后不會形成酸類物質(zhì)，而是脫羧成中性物質(zhì)；不分解含硫氨基酸或含硫化合物，不能使苯丙氨酸脫氨變成苯丙酮酸，不產(chǎn)類蛋白水解酶以及氧化酶。通過碳源同化試驗(yàn)得知，菌株能利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖、乳糖、鼠李糖等多種多糖和甘露醇、山梨醇等醇類物質(zhì)，但是不能利用纖維二糖。

2.3.2分子生物學(xué)鑒定結(jié)果基于測序結(jié)果，將序列結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對分析，在LPSN上選取同源性較高的模式菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，由系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果(圖4)可知，菌株YT5-1-1與香坊腸桿菌(Enterobacterxiangfangensis)親源關(guān)系最近。YT5-1-1序列已提交至NCBI，登陸號為MN515058。綜合該菌株的菌落形態(tài)、生理生化特性和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定獲得的纖維素分解菌YT5-1-1為香坊腸桿菌。

2.4 YT5-1-1菌株產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.4.1最適接種量的確定不同 YT5-1-1接種量產(chǎn)生的CMCase和FPase活力結(jié)果見圖5，可見，在接種量為2%時(shí)，CMCase和FPase活力最大；其他接種量條件下，CMCase和FPase活力均低于2%接種量。說明YT5-1-1菌株在接種量為2%時(shí)效果最佳，反映YT5-1-1的產(chǎn)酶效果與菌體濃度有關(guān)，菌體濃度增大，會提升酶活力，但濃度過大反而會降低酶活力，這可能與培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)含量會隨著接種量的變化而變化有關(guān)。

表3 菌株YT5-1-1的生理生化特性Table 3 Physiological-biochemical characteristics of YT5-1-1

圖4 菌株YT5-1-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of YT5-1-1

2.4.2最適初始pH的確定不同初始pH條件下，菌株YT5-1-1所產(chǎn)生的CMCase和FPase活力結(jié)果見圖6，隨著發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH增加，CMCase和FPase活力逐漸增大，在初始pH為4時(shí)，CMCase和FPase活力最大，之后隨著pH繼續(xù)增加，CMCase和FPase活力逐漸下降，在pH為7時(shí)降至最低，pH繼續(xù)增加，酶活力保持不變。整體酶活力在pH為3～5時(shí)，CMCase和FPase維持較高的活性，說明菌株YT5-1-1在偏酸性條件下更有利于酶的產(chǎn)生。

注：同種酶不同字母表示不同處理間的差異在P<0.05水平具有顯著性。Note: Different lowercase letters of the same enzyme indicate significant differences between different treatments at P<0.05 level.圖5 不同接種量下菌株YT5-1-1的產(chǎn)酶活力Fig.5 Enzymes activities produced by strain YT5-1-1 under different inoculation amounts

圖6 不同初始pH下菌株YT5-1-1的產(chǎn)酶活力Fig.6 Enzymes activities produced by strain YT5-1-1 under different initial pH

2.4.3最適培養(yǎng)溫度的確定不同溫度條件下CMCase和FPase活力結(jié)果見圖7，隨著培養(yǎng)溫度的升高，CMCase和FPase活力逐漸增大，在培養(yǎng)溫度為30 ℃時(shí)達(dá)到最大。之后在30～45 ℃之間時(shí)，隨著溫度繼續(xù)升高，酶活力呈持續(xù)下降趨勢。表明菌株YT5-1-1的生長和代謝與溫度密切相關(guān)，30 ℃是其最佳培養(yǎng)溫度。

圖7 不同培養(yǎng)溫度下菌株YT5-1-1的產(chǎn)酶活力Fig.7 Enzymes activities produced bystrain YT5-1-1 under different culture temperatures

2.4.4最適發(fā)酵時(shí)間的確定在37 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)，不同發(fā)酵時(shí)間的CMCase和FPase活力結(jié)果見圖8，CMCase和FPase活力隨著發(fā)酵時(shí)間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在42 h之前，酶活力較低，可能是因?yàn)榫赀€處于產(chǎn)酶積累期，所以酶活力未達(dá)到最高值；隨著菌體濃度的增大和底物對CMCase和FPase的誘導(dǎo),導(dǎo)致酶量積累，在42 h時(shí)酶活力達(dá)到最大值，分別為(0.556±0.011)和(0.834±0.017)IU·mL-1。延長發(fā)酵時(shí)間，酶活力持續(xù)降低，可能是因?yàn)殡S著發(fā)酵時(shí)間的增加，營養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗、菌體自身的產(chǎn)酶能力下降,從而導(dǎo)致酶活力下降。

圖8 不同發(fā)酵時(shí)間下菌株YT5-1-1的產(chǎn)酶活力Fig.8 Enzymes activities produced by strain YT5-1-1 under different fermentation times

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

以接種量、初始pH、培養(yǎng)溫度和發(fā)酵時(shí)間為響應(yīng)變量，CMCase活力為響應(yīng)值，采用Design-Expert 軟件分析得到自變量與CMCase活力的二次回歸方程式：Y=-44.783 05+0.665 07A+2.166 13B+1.563 11C+0.855 5D+0.145AB-0.019 3AC+0.031 458AD-0.020 5BC+0.015 583BD-0.002 65CD-0.520 1A2-0.306 2B2-0.021 869C2-0.010 669D2。式中，Y為CMCase活力 (IU·mL-1)，A為接種量(%)，B為初始pH，C為培養(yǎng)溫度(℃)，D為發(fā)酵時(shí)間(h)。模型的方差分析結(jié)果(表4)表明，對CMCase活力的二次多項(xiàng)式模型具有高度顯著性(P<0.000 1)，方程負(fù)相關(guān)系數(shù)平方(R2)為0.961，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.797 7)。因此，模型與實(shí)際擬合較好，可以用此模型對產(chǎn)CMCase活力條件進(jìn)行優(yōu)化。

對方程中變量進(jìn)行方差分析，結(jié)果(表5)可以看出，優(yōu)化產(chǎn)CMCase活力條件時(shí)，影響CMCase活力的主要因素按照主次順序排列為培養(yǎng)溫度>接種量>初始pH>發(fā)酵時(shí)間，在所選各因素水平范圍，變量A、C、AB、AD、A2、B2、C2、D2對Y的影響均達(dá)到顯著水平。

等高線的橢圓程度反映了交互作用的大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形表示兩者交互作用較弱。三維解析表面的陡峭程度可以直觀地反映變量與響應(yīng)量之間的相關(guān)性。由于本研究中交互作用對響應(yīng)值的影響數(shù)值較多，因此只分析P<0.05的數(shù)據(jù)。圖9A中，接種量和初始pH所對應(yīng)的CMCase活力等高線彎曲明顯，所以接種量和初始pH的交互項(xiàng)對CMCase活力有影響，且兩者的交互作用顯著。圖9C中，接種量和發(fā)酵時(shí)間所對應(yīng)的CMCase活力等高線彎曲程度更大，證明接種量和發(fā)酵時(shí)間的交互作用對CMCase活力的影響是大于接種量和初始pH的交互作用。通過觀察圖9B和圖9D可知，當(dāng)接種量范圍在1%～2%之間，響應(yīng)值的上升趨勢趨于平緩，而當(dāng)接種量超過2.5%以后，響應(yīng)值快速下降，這可能與菌體濃度增加導(dǎo)致生長抑制，從而影響CMCase活力有關(guān)；當(dāng)接種量一定時(shí)，響應(yīng)值隨著初始pH和發(fā)酵時(shí)間的增加，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢且相對平緩，這表明初始pH和發(fā)酵時(shí)間的變化對CMCase活力的影響與發(fā)酵時(shí)間相比較弱。根據(jù)實(shí)際情況和Design-Expert軟件進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，優(yōu)化的最佳參數(shù)為：接種量2.6%、初始pH 4.56、培養(yǎng)溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間43 h。在此條件下，預(yù)測CMCase活力最大為1.819 IU·mL-1。

2.6 YT5-1-1對酒糟中纖維素的降解能力

菌株YT5-1-1發(fā)酵酒糟過程中的各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果見表6，可見，試驗(yàn)組與空白組的pH間無顯著差異，兩組的變化趨勢基本相同。在前7 d的發(fā)酵過程中，pH基本無變化，7～14 d時(shí)，空白組和試驗(yàn)組的pH都出現(xiàn)顯著下降，下降到3.76±0.01的水平。在14～21 d時(shí)，pH開始顯著回升。在酒糟的發(fā)酵過程中，各組的pH均處于波動(dòng)狀態(tài)但波動(dòng)幅度不大，且各組的變化情況基本相同，無明顯差異。因此認(rèn)為，菌株YT5-1-1不會對酒糟發(fā)酵過程中的pH產(chǎn)生影響。在發(fā)酵過程中，各階段干物質(zhì)含量都出現(xiàn)降低，在前7 d的發(fā)酵過程中，空白組和試驗(yàn)組的干物質(zhì)含量顯著下降，此時(shí)空白組的干物質(zhì)含量下降程度顯著高于試驗(yàn)組，達(dá)到(37.06±0.76)%。在后續(xù)的酒糟發(fā)酵過程中，空白組的干物質(zhì)含量持續(xù)下降，而試驗(yàn)組的干物質(zhì)含量在發(fā)酵14～21 d基本處于穩(wěn)定狀態(tài)。在酒糟的發(fā)酵過程中，空白組和試驗(yàn)組的NDF和ADF含量均隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而持續(xù)降低；并且相同處理時(shí)間的試驗(yàn)組的NDF和ADF含量均顯著低于空白組。在前7 d的發(fā)酵過程中，空白組和試驗(yàn)組的D-HC無明顯差異；在7～14 d，試驗(yàn)組的D-HC含量開始顯著高于空白組；直到發(fā)酵結(jié)束，試驗(yàn)組的D-HC含量較空白組顯著提高4.18%；在整個(gè)發(fā)酵過程中，試驗(yàn)組的D-CL含量一直顯著高于空白組，且隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，兩組的D-CL含量也顯著增加，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，試驗(yàn)組的D-CL含量較空白組提高了3.46%。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，試驗(yàn)組的D-HC和D-CL較發(fā)酵前分別提高了11.62%和21.08%。

A：接種量和初始pH對響應(yīng)值交互作用的等高線圖；B：接種量和初始pH對響應(yīng)值交互作用的三維解析表面；C：接種量和發(fā)酵時(shí)間對響應(yīng)值交互作用的等高線圖；D：接種量和發(fā)酵時(shí)間對響應(yīng)值交互作用的三維解析表面A：Contour plot of interaction between inoculation amount and initial pH on response value；B：Three-dimensional analytical surface of interaction between inoculation amount and initial pH on response value；C：Contour plot of interaction between inoculation amount and fermentation time on response value；D：Three-dimensional analytical surface of interaction between inoculation amount and fermentation time on response value圖9 接種量和初始pH、接種量和發(fā)酵時(shí)間對響應(yīng)值交互作用的影響Fig.9 Effects of inoculation amount and initial pH, inoculation amount and fermentation time on the interaction of response value

表6 添加YT5-1-1后酒糟指標(biāo)的變化Table 6 Changes of vinasse parameters after fermentation with YT5-1-1

3 討論

采用CMC-Na平板法進(jìn)行篩選，結(jié)合剛果紅染色，并參照菌落周圍透明圈直徑/菌落直徑比值大小，是分離篩選纖維素分解菌的常用方法[22]。但D/d比值并不能作為衡量纖維素酶活力大小的唯一標(biāo)準(zhǔn)，還需要利用DNS法測定纖維素酶活力進(jìn)行復(fù)篩，一方面是由于纖維素酶是誘導(dǎo)酶，在發(fā)酵過程中會受到瓊脂中淀粉和明膠等物質(zhì)的影響，使結(jié)果出現(xiàn)假陽性；另一方面纖維素酶活力與D/d比值呈弱相關(guān)[23-24]。本研究采用CMC-Na平板篩選產(chǎn)纖維素酶菌株，結(jié)合羧甲基纖維素酶和濾紙酶活力，從雙峰駝的糞便中篩選出一株具有較高纖維素酶活力的菌株YT5-1-1，初步鑒定該菌株為香坊腸桿菌。香坊腸桿菌屬腸桿菌屬，廣泛分布于自然界，普遍存在于人和動(dòng)物中。已有研究證實(shí)，陰溝腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌具有降解纖維素的能力[25]，而本研究關(guān)于香坊腸桿菌具有纖維素降解能力的結(jié)果是首次報(bào)道。目前，香坊腸桿菌已從傳統(tǒng)酸面團(tuán)、腌冬瓜、刺葡萄表皮和甘蔗渣中分離得到[26]，而從動(dòng)物腸道中分離得到，也是首次報(bào)道。

在微生物的生長繁殖過程中，接種量、初始pH、培養(yǎng)溫度和發(fā)酵時(shí)間都是影響其生長和代謝的重要因素[27]。本研究先以接種量、初始pH、培養(yǎng)溫度和發(fā)酵時(shí)間這4個(gè)對纖維素酶活力影響較大的因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，然后在單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)菌株YT5-1-1在接種量為2.6%時(shí)酶活力達(dá)到最大，YT5-1-1的接種量較低，能很好的節(jié)約生產(chǎn)成本。YT5-1-1的整體酶活力在pH小于6的條件下能維持較高的活性，通過響應(yīng)面優(yōu)化后YT5-1-1菌株的最適培養(yǎng)pH為4.5，說明它可以對一些偏酸性的纖維素源材料進(jìn)行水解，這與纖維素酶的最適pH大多在4.0～5.5之間的研究結(jié)果[28]一致。培養(yǎng)溫度在25～40 ℃時(shí)，YT5-1-1的酶活都能達(dá)到50%以上，說明它在生產(chǎn)過程中有很好的適應(yīng)能力，最適培養(yǎng)溫度為30 ℃，這與香坊腸桿菌的最適生長溫度[29]相同。YT5-1-1的最適發(fā)酵時(shí)間為42 h，發(fā)酵周期較短。利用響應(yīng)面法對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后預(yù)測CMCase活力最大為1.819 IU·mL-1，比原來活力0.580 IU·mL-1提高了3.14倍，這與崔秀秀[30 ]以初始pH、發(fā)酵溫度、接種量為因子對纖維素降解菌進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，優(yōu)化后纖維素的酶活力與優(yōu)化前提高了2.96倍的結(jié)果相似。表明接種量2.6%、初始pH 4.5、培養(yǎng)溫度30 ℃和發(fā)酵時(shí)間42 h，是YT5-1-1菌株的較優(yōu)培養(yǎng)條件，此條件下預(yù)測YT5-1-1的CMCase活力可以大大提高。

目前關(guān)于添加纖維素降解菌來改善飼料品質(zhì)的研究取得了一定進(jìn)展。易戈等[31]利用熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)發(fā)酵白酒酒糟，其中的粗纖維降低了25.49%；盧向陽等[32]利用菌種混合發(fā)酵白酒酒糟，粗纖維降低了41.4%，證實(shí)纖維素降解菌的添加能有效降低酒糟中的粗纖維含量。本研究分離得到的香坊腸桿菌YT5-1-1，具有較高的酒精耐受度[29]，因此可以將其應(yīng)用在對酒糟中纖維素降解的研究中。根據(jù)發(fā)酵前后酒糟的pH、干物質(zhì)含量、中性洗滌纖維含量和酸性洗滌纖維含量的變化來看，YT5-1-1在酒糟發(fā)酵過程中，對酒糟pH的影響較小，試驗(yàn)組的干物質(zhì)含量較空白組顯著增加，這可能與酒糟在發(fā)酵過程中的蛋白質(zhì)含量變化[18]有關(guān)。空白組的NDF和ADF含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長均出現(xiàn)下降，這可能是因?yàn)榫圃銟悠吩诎l(fā)酵過程中與空氣接觸，導(dǎo)致其進(jìn)一步降解[33]，從而使酒糟中的NDF含量和ADF含量下降。添加菌劑YT5-1-1的試驗(yàn)組的NDF和ADF含量較空白組顯著下降，證明YT5-1-1確實(shí)能夠降解酒糟中的纖維素，從而降低纖維素含量。本研究中，試驗(yàn)組的D-HC和D-CL降解率顯著高于空白組，表明酒糟發(fā)酵過程中，YT5-1-1能夠表現(xiàn)出其最佳的纖維素降解效率。因此，香坊腸桿菌YT5-1-1能顯著改善酒糟的飼用價(jià)值，具有很大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。