施氏假單胞菌在玉米根際的固氮效率和促生效果研究

楊華, 李江, 張維, 周正富, 燕永亮, 郭嘉,劉相國(guó), 郝東云, 林敏, 柯秀彬*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081; 2.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院, 四川 綿陽(yáng) 621010; 3.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所, 長(zhǎng)春 130033)

氮素是土壤中的主要養(yǎng)分限制因子之一，氮肥投入是農(nóng)業(yè)高產(chǎn)的必要途徑[1]。中國(guó)已成為世界上較大的化肥生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)之一，導(dǎo)致我國(guó)氮肥過(guò)度使用的一個(gè)重要原因是我國(guó)農(nóng)作物氮肥利用效率普遍不高[2]。由于化肥利用率較低，氮肥通過(guò)揮發(fā)和淋溶等途徑損失數(shù)量巨大，引起如溫室氣體排放、水體富營(yíng)養(yǎng)化等一系列環(huán)境問(wèn)題[3-4]。面對(duì)人口壓力，中國(guó)農(nóng)業(yè)在未來(lái)發(fā)展中面臨著既要保持高產(chǎn)，又要減少農(nóng)田面源污染的雙重挑戰(zhàn)，如何提高氮肥利用率并降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中對(duì)氮肥的依賴，對(duì)于我國(guó)糧食安全和節(jié)能減排的可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略都具有十分重要的意義。

植物根際是宿主植物和微生物相互作用的主要活動(dòng)區(qū)[5],生存于植物根際的促生菌能直接或間接地促進(jìn)或調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)[6]。聯(lián)合固氮菌屬于植物促生菌的范疇，廣泛存在于非豆科植物(玉米和水稻等)根際，與宿主作物形成一個(gè)復(fù)雜的根際固氮體系[7-8]。聯(lián)合固氮菌促進(jìn)植物生長(zhǎng)的機(jī)理分為直接作用和間接作用。直接作用通過(guò)生物固氮為植物提供氮素、產(chǎn)生植物激素或產(chǎn)生鐵載體和各類維他命物質(zhì)以及通過(guò)磷元素的增溶作用來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)[9]。間接作用是通過(guò)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生植物激素、改善植物對(duì)礦物質(zhì)的利用率、抑制植物病原體或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生拮抗物質(zhì)等來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)。因此，通過(guò)根際聯(lián)合固氮作用為農(nóng)作物提供氮源、部分或完全替代化學(xué)氮肥，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最經(jīng)濟(jì)、最環(huán)保和最高效的氮素供應(yīng)方式。鑒于聯(lián)合固氮作用在農(nóng)作物節(jié)肥增產(chǎn)方面具有巨大的應(yīng)用潛力，以聯(lián)合固氮菌為有效菌種并開(kāi)發(fā)研制的微生物肥料已經(jīng)廣泛應(yīng)用在田間接種。

固氮施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)A1501分離自我國(guó)南方水稻根際，屬于模式根際聯(lián)合固氮菌，具有高效固氮活力和根際定殖優(yōu)勢(shì)[10]。已有研究表明，野生型A1501能夠顯著促進(jìn)水稻和玉米的生長(zhǎng)，并通過(guò)生物固氮為宿主植物提供氮素[11-12]。但是野生型的根際聯(lián)合固氮受環(huán)境因素影響大，具有固氮效率不高和田間接種不穩(wěn)定等缺陷。針對(duì)這些缺陷，可采取如下策略：一方面應(yīng)用基因工程構(gòu)建耐銨、泌銨型聯(lián)合固氮菌，將固定的銨分泌出菌體外；另一方面通過(guò)分子遺傳學(xué)手段獲得轉(zhuǎn)基因氮高效利用玉米品系改良作物對(duì)銨的吸收效率，通過(guò)微生物-植物相互作用建立根際高效固氮體系，進(jìn)一步探究根際固氮與植物促生效果的相互關(guān)系，實(shí)現(xiàn)微生物高效固氮和植物高效利用氮。因此，本研究利用轉(zhuǎn)基因氮高效利用玉米和固氮施氏假單胞菌野生型及泌銨工程菌構(gòu)建高效固氮體系，在溫室條件下評(píng)價(jià)固氮菌株對(duì)玉米的促生效果，并利用15N穩(wěn)定性同位素稀釋法測(cè)定根際生物固氮量，以期為完善根際高效聯(lián)合固氮體系構(gòu)建，促進(jìn)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的良性發(fā)展以及微生物肥料開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及活化

固氮施氏假單胞菌A1501具有高效固氮能力，屬于革蘭氏陰性菌，菌體呈桿狀[13]；在野生型A1501銨轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因amtB1/amtB2雙缺失突變株及固氮酶的正調(diào)節(jié)基因nifA組成型質(zhì)粒pVA3基礎(chǔ)上，通過(guò)三親接合方法[14]獲得泌銨工程菌1568/pVA3；突變株1502為對(duì)照菌株，其敲除了固氮功能基因nifH，喪失固氮能力，以上菌株均為本實(shí)驗(yàn)保存。

菌株在LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)后涂平板劃線培養(yǎng)，檢測(cè)菌株的生長(zhǎng)曲線、固氮酶活和泌銨能力等生理性狀，再轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至OD6001.0。菌液6 000 r·min-1離心10 min，棄上清液后用等量0.8%生理鹽水重懸備用。

1.2 供試菌株生理活性測(cè)定

1.2.1菌株培養(yǎng)挑取待測(cè)菌株接種于含對(duì)應(yīng)抗生素的LB 液體培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。4 ℃、4 000 r·min-1離心10 min 收集培養(yǎng)過(guò)夜的菌株，經(jīng)0.85%的NaCl 溶液洗滌菌體2次，轉(zhuǎn)接至A15培養(yǎng)基中[15]，調(diào)整初始OD600至0.1，30 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣測(cè)定菌株的OD600，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.2固氮酶活性測(cè)定取10 mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，6 000 r·min-1離心10 min，再使用0.85%的NaCl溶液懸浮洗滌菌體沉淀2次，取1 mL OD600為1.0的菌液轉(zhuǎn)接至裝有9 mL A15無(wú)氮源培養(yǎng)基的三角瓶中，初始OD600為0.1，體積為10 mL。蓋上膠塞，密封瓶口，充氬氣4 min 用以排出三角瓶中的空氣。向瓶中注入0.5%的氧氣和10%的乙炔。實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)重復(fù)，30 ℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)。每隔2 h用微量進(jìn)樣器從瓶中抽取250 μL氣體注入氣相色譜儀中(SP-2305型氣相色譜儀)檢測(cè)乙烯含量，記錄乙烯峰面積，利用公式計(jì)算固氮酶的活性。

1.2.3固氮菌株泌銨能力測(cè)定挑取待測(cè)菌株接種于含對(duì)應(yīng)抗生素的LB 液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，菌株離心收集后轉(zhuǎn)至10 mL A15液體培養(yǎng)基中，調(diào)整初始OD600為0.1。菌液在固氮條件下培養(yǎng)72 h后收集上清液利用酶標(biāo)儀(Molecular Devices Flexstaion 3，美國(guó))測(cè)定銨離子濃度[16]。實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)重復(fù)。

1.3 玉米品系

轉(zhuǎn)基因氮高效利用玉米品系與對(duì)照普通玉米品系的種子由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。轉(zhuǎn)基因氮高效利用玉米品系通過(guò)轉(zhuǎn)ZmAMT1.1基因改良銨鹽高效吸收過(guò)程，提高玉米植株對(duì)氮素的吸收效率[17]。將編碼氨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的目的基因ZmAMT1.1和抗除草劑草銨膦篩選基因bar構(gòu)建到 pCAMBIA 3300-ZmAMT1.1-bar表達(dá)載體上，以玉米Hill為受體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米幼胚轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因玉米。利用除草劑篩選、PCR、RT-PCR、Southern blot等技術(shù)驗(yàn)證目的基因插入玉米基因組中，穩(wěn)定表達(dá)，且多世代穩(wěn)定遺傳。該玉米品系進(jìn)入農(nóng)業(yè)部中間試驗(yàn)階段，中間試驗(yàn)批文號(hào)為農(nóng)基安辦報(bào)告字(2019)第122號(hào)。

1.4 菌株接種

試驗(yàn)在吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溫室(公主嶺)進(jìn)行。接種固氮菌設(shè)置5個(gè)處理：泌銨工程菌1568/pVA3、野生型菌株A1501、nifH基因突變菌株1502以及50 mg N·kg-1土施氮處理和不接種處理對(duì)照，接種和不接種對(duì)照均不施加氮肥；玉米品種包括2個(gè)處理(轉(zhuǎn)基因高效利用品系和對(duì)照品系)；試驗(yàn)設(shè)置8個(gè)重復(fù)。

將玉米種子在無(wú)菌水中浸泡清洗30 min后轉(zhuǎn)移至5% NaClO溶液中浸泡1 min，在75%乙醇中處理2 min，最后用無(wú)菌水清洗5次。表面消毒后的種子分別放入準(zhǔn)備好的菌懸液以及滅菌的野生型懸浮液(不接種對(duì)照)浸泡30 min。將浸泡后的玉米種子放入裝有2.5 kg土壤基質(zhì)(Klasmann-Deilmann)的塑料盆中(內(nèi)徑20 cm、高20 cm)，每盆4顆種子，每組8個(gè)重復(fù)。玉米出苗后間苗至2顆·盆-1，玉米生長(zhǎng)周期內(nèi)按照正常管理。種植60 d后分別測(cè)定玉米地上和地下部生長(zhǎng)量。

1.5 生物固氮量測(cè)定

試驗(yàn)開(kāi)始前兩周將15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的硫酸銨(濃度為50 mg N·kg-1土壤，豐度為10%)加入土壤中并充分混合待用。經(jīng)菌液浸泡后的玉米種子放入盆裝土壤中。栽培60 d后取部分根系及莖葉烘干至恒重，研磨過(guò)100目篩后，經(jīng)穩(wěn)定性同位素質(zhì)譜(同位素分析儀-穩(wěn)定性同位素質(zhì)譜儀聯(lián)用，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)重復(fù)。生物固氮百分率以從空氣中固定的氮素占植物總氮量的百分比(%Ndfa)來(lái)表示，計(jì)算方法如下。

%Ndfa=(1-atom%15NFexcess/atom%15NNFexcess)×100%

式中，atom%15NFexcess為接種固氮菌玉米體內(nèi)15N原子百分超；atom%15NNFexcess為接種喪失固氮能力的突變株玉米體內(nèi)15N原子百分超。計(jì)算結(jié)果以3次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示。

植物體內(nèi)總的固氮量(Nfixed)按以下公式計(jì)算。

Nfixed(g) =Nt×%Ndfa × Biomass

式中，Nt為植物總氮含量；Biomass為植株地上和地下部的生物量總和， g·株-1。

針對(duì)15N穩(wěn)定性同位素稀釋法獲得的玉米生物固氮量數(shù)據(jù)，對(duì)玉米的節(jié)肥量進(jìn)行估算。假定玉米正常尿素施用量是375 kg·hm-2(約187.5 kg N·hm-2)，估算節(jié)肥率。

生物固氮量(kg·hm-2)=

1.6 數(shù)據(jù)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)包括玉米的株高、株重、根重及穩(wěn)定性同位素分析數(shù)值處理均利用SPSS 20.0軟件(IBM，美國(guó))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 固氮菌株生長(zhǎng)曲線分析

三株待測(cè)菌株的生長(zhǎng)曲線(圖1)表明，固氮施氏假單胞菌野生型A1501、泌銨菌1568/pVA3和nifH基因突變株1502在LB培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)基本一致，均在2 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在8～10 h時(shí)到達(dá)平臺(tái)期。

2.2 固氮酶活性分析

酶活測(cè)定結(jié)果(圖2)表明，泌銨菌1568/pVA3的固氮酶活達(dá)到1 477 nmol C2H4·mg-1protein·h-1，略高于野生型的固氮酶活(約1 350 nmol C2H4·mg-1protein·h-1)，而nifH基因缺失突變株1502未檢測(cè)到固氮酶活。

2.3 泌銨特性分析

在固氮條件下，培養(yǎng)72 h后泌銨菌1568/pVA3的胞外銨離子濃度達(dá)到18 μmol·L-1，而野生型和nifH基因突變菌株的培養(yǎng)基中均未檢測(cè)到銨離子(圖3)。以上結(jié)果表明，三株菌株的生長(zhǎng)、固氮、泌銨等生理活性正常，可用于后續(xù)的接種實(shí)驗(yàn)。

圖1 固氮施氏假單胞菌野生型及其衍生菌株生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth properties of wild-type A1501 and mutant strains in LB liquid medium

注：n.d.表示未檢出數(shù)值。Note: n.d. indicates no detection.圖2 固氮施氏假單胞菌野生型及其衍生菌株固氮酶活Fig.2 Nitrogenase activities of the wild-type A1501 and mutant strains

注：n.d.表示未檢出數(shù)值。Note: n.d. indicates no detection.圖3 固氮施氏假單胞菌野生型及其衍生菌株泌銨能力(72 h)Fig.3 Ammonium production of wild-type A1501 and mutant strains during 72 h incubation

2.4 固氮菌對(duì)玉米生長(zhǎng)的影響

玉米生長(zhǎng)第60 d采集地上和地下部測(cè)定植物生物量，包括株高、株重和根系重量，結(jié)果表明，固氮施氏假單胞菌接種顯著提高了玉米的生物量(表1，圖4)。固氮施氏假單胞菌接種氮高效利用和對(duì)照玉米品系的地上和地下部生物量都顯著高于不接種對(duì)照。在氮高效利用玉米聯(lián)合固氮體系中，接種1568/pVA3菌株的植株生物量較施肥處理提高25.5%，較不接種對(duì)照提高36.4%；接種A1501菌株的植株生物量較施肥處理提高24.8%，較不接種對(duì)照提高35.6%。在對(duì)照玉米聯(lián)合固氮體系中，接種1568/pVA3菌株的植株生物量較不接種增加17.6%，接種A1501菌株后植株生物量較不接種增加20.7%。但是，固氮菌接種處理對(duì)氮高效利用玉米和對(duì)照玉米植株的總生物量沒(méi)有顯著影響。

接種固氮菌后,氮高效利用和對(duì)照玉米品系的株高都顯著高于不接種對(duì)照(P<0.05)，接種固氮菌后氮高效利用玉米品系的平均株高顯著(P<0.05)高于對(duì)照玉米品系。對(duì)于氮高效利用玉米品系，接種野生型A1501和泌銨菌1568/pVA3后玉米平均株高分別達(dá)到131和126 cm，而接種nifH突變株1502和施氮處理的玉米平均株高約124 cm，均顯著高于不接種處理(P<0.05)。對(duì)于普通玉米品系，接種固氮菌株和施氮處理的玉米株高約為122 cm，也均顯著(P<0.05)高于不接種處理。

玉米根系發(fā)育結(jié)果(表1)顯示，兩個(gè)玉米品系在相同處理?xiàng)l件下接種野生型A1501、泌銨菌1568/pVA3和nifH突變株1502的玉米植株根系重量均顯著高于不接種對(duì)照。

2.5 15N稀釋法測(cè)定固氮菌株對(duì)玉米根際固氮量影響

利用15N稀釋法對(duì)接種至玉米根際固氮菌的固氮能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果(表2)表明，野生型和泌銨固氮菌接種都顯著提高了玉米植株的全氮含量(N%)、植株15N原子百分超、固氮百分率和固氮量。

A:氮高效玉米：B:對(duì)照玉米。1—不接種對(duì)照；2—氮肥處理；3—接種nifH基因突變株；4—接種野生型；5—接種泌銨菌(1568/pVA3)。A: High N utilization maize; B: Control maize. 1—control without inoculation; 2—N fertilization treatment; 3—Inoculation with nifH mutant strain (1502); 4—Inoculation with wild-type; 5—Inoculation with ammonium-excreting mutant strain (1568/pVA3).圖4 固氮施氏假單胞菌野生型及其衍生菌株接種的玉米植株Fig.4 Inoculation of maize with P. stuzeri wild-type and mutant strains

對(duì)于氮高效利用玉米聯(lián)合固氮體系，接種1568/pVA3菌株后植株全氮含量相對(duì)于不接種對(duì)照增加39%，生物固氮貢獻(xiàn)率為21.5%，經(jīng)換算后生物固氮量為0.8 g·株-1，估算每公頃的生物固氮量為48 kg，節(jié)肥率約為25.6%。接種A1501菌株后植株全氮含量相對(duì)于不接種對(duì)照增加29%，生物固氮量貢獻(xiàn)率為18.5%，經(jīng)換算后生物固氮量為0.64 g·株-1，估算每公頃的生物固氮量為38.4 kg，肥料節(jié)約率約為20.4%。

對(duì)于對(duì)照玉米聯(lián)合固氮體系，接種1568/pVA3后植株全氮含量相對(duì)于不接種對(duì)照增加12%，生物固氮量貢獻(xiàn)率為10.1%，經(jīng)換算后生物固氮量約為0.27 g ·株-1，估算每公頃的生物固氮量為16.2 kg，節(jié)肥率約為8.6%。接種A1501菌株后植株全氮含量相對(duì)于不接種對(duì)照增加1.3%，生物固氮貢獻(xiàn)率為8.0%，經(jīng)換算后生物固氮量為0.2 g·株-1，估算每公頃的生物固氮量為12 kg，節(jié)肥率約為6.4%。

表1 固氮施氏假單胞菌A1501及其衍生菌株接種后玉米植株的生長(zhǎng)指標(biāo)Table 1 Effect of inoculation with P. stutzeri A1501 wild-type and mutant strains on maize plant growth

3 討論

3.1 泌銨工程菌促生機(jī)理探討

相對(duì)于共生結(jié)瘤固氮，非豆科根際聯(lián)合固氮受環(huán)境因素影響大，固氮效率低(1～50 kg·hm-2·a-1)[18]。更重要的是固氮作用是一個(gè)耗能的反應(yīng)，固氮微生物很少主動(dòng)向外分泌合成的銨，并且固氮酶的表達(dá)和活性受活性銨的抑制。因此，打破銨抑制，構(gòu)建泌銨固氮菌株一直是生物固氮研究的熱點(diǎn)問(wèn)題[19]。構(gòu)建泌銨固氮工程菌的策略有化學(xué)誘變、定位突變銨同化、銨轉(zhuǎn)運(yùn)或固氮負(fù)調(diào)節(jié)基因等[20]。本文使用的1568/pVA3是通過(guò)對(duì)野生型A1501進(jìn)行基因操作獲得，野生型含有amtB1和amtB2兩個(gè)編碼銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，并與glnK共同組成一個(gè)操縱子。在氮限制性條件下，AmtB蛋白將細(xì)胞外的銨轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。通過(guò)增強(qiáng)nifA基因表達(dá)以提高固氮酶活，將其轉(zhuǎn)入amtB1和amtB2雙缺失突變株中，從而獲得耐銨泌銨固氮工程菌[13]。本研究中野生型及其衍生菌株在長(zhǎng)特性等方面沒(méi)有顯著差異，表明對(duì)野生型進(jìn)行基因敲除等操作不會(huì)影響固氮菌的其他生理活性如生物膜形成或根際定殖能力。本研究的目的之一是驗(yàn)證泌銨工程菌1568/pVA3能否促進(jìn)玉米植株的生長(zhǎng)，以及提供植物宿主更多生物固定的氮。與不接種對(duì)照相比，1568/pVA3菌株接種顯著促進(jìn)了玉米植株的地上部和地下部的生物量以及植株的高度。但是1568/pVA3菌株和野生型A1501對(duì)玉米的促生效果相似，兩者沒(méi)有顯著性差異。這與有些研究結(jié)果不一致，例如巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)泌銨突變菌株對(duì)玉米的促生效果較野生型提高近50%[21]。接種巴西固氮螺菌泌銨工程菌株后，小麥地上和地下部生物量分別提高30%和31%[22]。這種差別可能與不同固氮菌株的泌銨能力及接種條件如土壤性質(zhì)、植物生長(zhǎng)時(shí)期等因素有關(guān)。同時(shí)除了生物固氮，聯(lián)合固氮菌具有多種促生機(jī)制如分泌植物生長(zhǎng)激素或溶磷等功能可能被忽略[22]。本研究中，1502接種后玉米的株高和生物量等都顯著高于不接種對(duì)照。15N穩(wěn)定性同位素稀釋法分析結(jié)果表明相對(duì)于野生型，接種泌銨菌1568/pVA3后玉米植株內(nèi)從空氣中固定的氮素占植物總氮量的百分比(%Ndfa)提高1.9%～3.0%，生物固氮量提高0.07～0.16 g·株-1。這表明泌銨工程菌比野生型具有更高的固氮活性并能提供宿主更多生物固定的氮。這一結(jié)果與之前的研究結(jié)論一致，Pankievic等[23]發(fā)現(xiàn)在C4植物狗尾草中，接種巴西固氮螺菌泌銨菌株后宿主體內(nèi)生物固定的氮較接種野生型提高了16倍之多。試驗(yàn)室培養(yǎng)條件下72 h后1568/pVA3泌銨菌株能夠向胞外分泌的銨濃度達(dá)到18 μmol·L-1，低于Azotobactervinelandii[24]、PseudomonasprotegensPf-5 X940[24]和Azospirillumbrasilense等工程菌的泌銨能力(20～2 000 μmol·L-1)。但是當(dāng)1568/pVA3與野生型接種至玉米植物，泌銨菌接種后根際土可以檢測(cè)到的銨離子濃度要顯著高于野生型(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。泌銨菌接種后銨離子在根際土中富集的現(xiàn)象在Setten等[25]的研究中也有發(fā)現(xiàn)。以上結(jié)果表明，泌銨菌和野生型都能顯著促進(jìn)玉米的生長(zhǎng)，同時(shí)泌銨菌具有泌銨能力，因而能給植物宿主提供更多生物固定的氮。

表2 接種固氮施氏假單胞菌A1501及其衍生菌株的生物固氮量評(píng)價(jià)Table 2 Evaluation of the nitrogen-fixing capacity of maize inoculated with P. stuzeri wild-type and mutant strains using 15N isotope-dilution method

3.2 高效聯(lián)合固氮系統(tǒng)的建立策略及啟示

通過(guò)分子遺傳學(xué)途徑進(jìn)行玉米品質(zhì)改良是提高玉米氮素利用效率，減肥高產(chǎn)的重要手段之一，但是存在周期長(zhǎng)、篩選率低等缺點(diǎn)[26-27]。本研究使用的轉(zhuǎn)基因氮高效利用玉米品系通過(guò)轉(zhuǎn)ZmAMT1.1基因進(jìn)行生理性狀改良，在低氮條件下可提高植物銨鹽高效吸收過(guò)程，提高玉米植株對(duì)氮素的吸收效率。除了構(gòu)建高效的泌銨工程菌，本研究利用氮高效利用玉米品系作為植物宿主，與泌銨工程菌形成高效聯(lián)合固氮體系，同時(shí)假設(shè)氮高效玉米聯(lián)合固氮體系具有更高的生長(zhǎng)量和生物固氮量。結(jié)果證實(shí)，野生型接種后氮高效玉米的株高顯著高于相同處理?xiàng)l件下的普通玉米，同時(shí)，泌銨菌接種后氮高效玉米的株高和根系生長(zhǎng)量均顯著高于相同處理?xiàng)l件下的普通玉米。盡管固氮施氏假單胞菌接種對(duì)氮高效利用玉米和對(duì)照玉米植株地上和地下部總生物量沒(méi)有顯著影響，這可能與本研究所用土壤基質(zhì)的養(yǎng)分條件有關(guān)。值得注意的是，野生型和泌銨菌接種后氮高效利用玉米總生物量較不接種對(duì)照均提高約36%，較氮肥處理均提高約25%；而野生型和泌銨菌接種后的普通玉米總生物量較不接種對(duì)照提高18%左右，較氮肥處理減少5.5%左右。這表明在固氮菌和氮高效利用玉米形成的聯(lián)合固氮體系中，固氮菌接種處理對(duì)植物生物量的提升作用更明顯。此外，相對(duì)于普通玉米品系，泌銨菌和野生型接種后的氮高效利用玉米植株氮含量提高41%～45%，生物固氮量提高196%～220%。以上結(jié)果表明，固氮菌與氮高效利用玉米形成的聯(lián)合固氮系統(tǒng)可以使植物獲得具有更高的生物固氮量。

本研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的根際高效聯(lián)合固氮體系仍然易受環(huán)境因素的影響，尤其在逆境條件下呈現(xiàn)固氮效率低等特點(diǎn)(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。因此，在下一步研究工作中，可以利用合成生物學(xué)技術(shù)在人工固氮系統(tǒng)中增加特定的抗逆模塊，以及與根際定殖相關(guān)的菌群競(jìng)爭(zhēng)性模塊，進(jìn)一步提高根際聯(lián)合固氮體系對(duì)逆境的耐受性。此外通過(guò)采取構(gòu)建多個(gè)微生物底盤的策略，人工設(shè)計(jì)根際有益微生物組，在群體水平上通過(guò)多種互作機(jī)制提高植物抗逆性并促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[28-30]。

本研究針對(duì)聯(lián)合固氮作用的天然缺陷，構(gòu)建泌銨固氮菌-氮高效利用玉米聯(lián)合固氮體系，并在溫室條件下對(duì)該體系的玉米植株生物量與生物固氮量進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，泌銨固氮菌和野生型接種都顯著促進(jìn)了玉米的生長(zhǎng)，同時(shí)泌銨固氮菌相對(duì)于野生型能為植物宿主提供更多生物固定的氮。因此，固氮菌與氮高效利用玉米的聯(lián)合固氮系統(tǒng)可以使植物獲得具有更高的生物固氮量，本研究可為生物固氮合成生物學(xué)的進(jìn)一步研究和微生物肥料的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。