微生物種衣劑的研制及其對玉米苗期生長的影響

周茂超, 黃艷娜, 段賽菲, 束仕元, 唐雪明*

(1.上海海洋大學食品學院， 上海 201306； 2.上海農業科學院生物技術研究所， 上海 201106)

玉米是我國的主要糧食、飼料與工業原料作物，對國民經濟發展具有重要作用。隨著玉米地位的提升，提高玉米的品質和總產量已經成為我國農業發展的重要研究方向。影響玉米產量的重要因素之一是土傳病害的侵染，因此抑制病害的發生是提高玉米產量的關鍵。玉米莖腐病又稱莖基腐病或青枯病，是世界玉米產區普遍發生的一種土傳病害，也是我國玉米產區的主要病害之一[1]。目前對于該病害的防治主要是協調運用生物防治和化學防治等措施。

種衣劑是將一種或多種活性成分與粘合劑和著色劑結合的組合物，在種子消毒、緩釋藥肥、防治病蟲鼠害、提高作物抗逆性和降低環境污染等方面發揮著重要作用。而生物種衣劑是以生物制劑為有效成份的一種新型環保種衣劑，含有對作物有益的微生物或其分泌物，如木霉菌、根瘤菌，固氮菌等。根據生物菌類之間的拮抗原理，篩選有益的拮抗菌，以抵抗有害病菌的繁殖、侵害，從而達到防病的目的。鑒于其環境友好性和可持續發展性，目前具有較好的應用潛力和價值。Zeng等[2]研究發現，由天然多糖聚合物和其他添加劑組成的玉米種衣劑對玉米紋枯病的防治率達到93.72%，抗害蟲率達81.29%，玉米增產17.75%。Wu等[3]研究發現，含有根際促生菌Klebsiellaoxtoca和Bacillussp.的生物種衣劑可以將棉花種子的發芽率提高11.3%，也提高了一些主要的植物防御酶活性。目前市場上所使用的玉米種衣劑大多數是農藥型種衣劑，許多種衣劑產品存在藥劑老化、性狀不穩定、包衣脫落率高等問題[4]，并且微生物在玉米種衣劑上的應用相對少[5]。因此，研究生物種衣劑對于玉米病害的防治具有十分重要的意義。本研究從微生物菌種資源庫中篩選出既有生防作用又有促生效果的菌株，將其與其他助劑一起配制成環保的生物種衣劑，應用于盆栽玉米種植中，探究其對玉米苗期生長的影響。本研究成果可為該生物種衣劑的生產和應用提供參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試菌株和玉米種子玉米莖腐病病原菌為禾谷鐮孢菌(Fusariumgraminearum)，待篩選拮抗菌包括TXM-1貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)、TXM-2解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、TXM-3解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、TXM-4短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、TXM-5枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、TXM-7蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、TXMT-2里氏木霉(Trichodermareesei)、TXMT-3里氏木霉(T.reesei)、TXMT-4哈茨木霉(Trichodermaharzianum)和TXMT-5綠色木霉(Trichodermaviride)10個菌株。以上菌株均由上海市農業科學院生物技術研究所唐雪明研究團隊篩選提供。供試玉米品種為‘申科糯1號’，種子由上海市農業科學院莊行基地提供。

1.1.2培養基PD液體培養基：葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，加水定容至1 L。PDA培養基：葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，瓊脂粉20 g，加水定容至1 L。LB液體培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，加水定容至1 L。MKB培養基：酪蛋白氨基酸5 g，甘油15 mL，K2HPO42.5 g，MgSO4·7H2O 2.5 g，加水定容于1 L。培養基均在121 ℃滅菌后使用。

1.1.3主要試劑及溶液的制備CAS檢測液：1 mmol·L-1鉻天青，4 mmol·L-1十六烷基三甲基溴化銨，0.1 mmol·L-1FeCl3溶液。Salkowski試劑：0.5 mol·L-1FeCl3與濃硫酸按體積比1∶20混合，加入500 mL水混合均勻。

成膜劑助劑制備：將海藻酸鈉溶液與聚乙烯醇溶液按照一定的比例混合，再加入5 g·L-1膨潤土和1 g·L-1苯甲酸鈉，用玻璃棒攪拌混勻。

主要試劑：葡萄糖、瓊脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、酪蛋白氨基酸、甘油、K2HPO4、MgSO4·7H2O 、濃硫酸，均購自國藥集團化學試劑有限公司。鉻天青、十六烷基三甲基溴化銨、FeCl3，購自上海生工生物工程股份有限公司。成膜劑和助劑：聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)、海藻酸鈉(sodium alginate)、苯甲酸鈉(sodium benzoate)，購自上海生工生物工程股份有限公司。膨潤土(bentonite)、著色珠光粉，購自深圳市航彩化工有限公司。

1.1.4主要儀器Evolution 60紫外分光光度計(美國賽默飛世爾科技公司)，ZWY-240搖床(上海智城分析儀器制造有限公司)，ZHJH-C1112C型超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)，DHP-9272型培養箱(太倉市華利達實驗設備有限公司)，XTL-208C型生物顯微鏡(上海明茲精密儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1拮抗菌的篩選用打孔器分別在木霉和病原菌上打孔，各挑一塊至平板兩側的中央，間距5～6 cm。芽孢桿菌則用移液槍頭點至距離病原菌塊2～3 cm處，放置于28 ℃培養箱倒置培養，以單獨培養的病原菌平板為對照。培養3～5 d后，測量對照組病原菌菌落的直線生長距離DCK、對峙培養組病原菌菌落的直線生長距離DS，用以下公式計算抑菌率。

(1)

1.2.2菌株的促生效果檢測菌株鐵載體的測定采用CAS法[6]。菌株于MKB培養基培養24～48 h，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液稀釋10倍，加入等體積CAS檢測液并混合，靜置1 h后于630 nm檢測吸光度A。將培養基稀釋10倍后與CAS等體積混合測得吸光度Ar，用以下公式計算鐵載體活性。

(2)

吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)的測定采用Salkowski試劑比色法[7]：將培養2～3 d的菌懸液5 000 r·min-1離心10 min，上清液與檢測液按1∶2比例混勻，在暗處放置30 min后測其在530 nm處吸光值，離心的空培養基作為空白對照。

1.2.3菌株對玉米種子發芽的影響試驗將玉米種子浸在1%NaClO溶液10 min，進行表面消毒，然后用無菌水清洗2～3次，洗去NaClO殘留液。將108cfu·mL-1的TXM-1和TXM-2菌液稀釋100、200、400倍，分別標為TXM-1-100、TXM-1-200、TXM-1-400和TXM-2-100、TXM-2-200、TXM-2-400，用不同濃度菌液浸泡種子3 h后晾干，置于有兩層浸濕濾紙的培養皿中培養，室溫培養48 h，每個重復10粒玉米，每個處理3個重復。7 d后測量胚芽與胚根長度，計算發芽率，以浸在無菌水中的種子作為對照(CK)。

1.2.4成膜劑理化性能的測定選用海藻酸鈉(SA)和聚乙烯醇(PVA)作為成膜劑，將SA和PVA分別按照90%SA+10%PVA、80%SA+20%PVA、70%SA+30%PVA、60%SA+40%PV、50%SA+50%PVA、40%SA+60%PVA、30%SA+70%PVA、20%SA+80%PVA、10%SA+90%PVA共9個體積分數配制藥劑。將配置好的藥劑于規格5 cm×15 cm的玻板上流延成膜，置于烘箱烘干后，用光學顯微鏡觀察其表面。將玉米種子先用75%乙醇表面消毒10 min，再置于超凈臺通風口風干。按照藥種質量體積比1∶10加入到燒杯中，攪拌混勻進行手動包衣。置于紗布上，至種子表面干燥不粘連，包衣后計時，測定成膜時間。包衣均勻度(uniformity rate of coating，D)和包衣脫落率(shedding rate of coating，X)的測定參考熊海蓉等[8]方法。隨機取出10和100粒包衣種子，分別置于兩個錐形瓶中，按照每顆種子0.4 mL加入乙醇，搖動1 min，在恒溫箱中放置20 min，每隔5 min搖動一次，每次30 s。取出冷卻至室溫，將液體稀釋相同倍數，在550 nm下測定吸光度，根據公式(3)計算包衣均勻度(D)。將包衣種子置于恒溫箱內烘15 min，使衣膜固化，取出室溫冷卻30 min，準確稱其質量，再轉入250 mL錐形瓶中，在振蕩器上振蕩1 h。將完整的種子取出，稱其質量，根據公式(4)計算包衣脫落率(X)。

(3)

式中，A1是10顆包衣種子用乙醇溶解衣膜稀釋后的吸光度值，A2是100粒包衣種子用乙醇溶解衣膜稀釋后的吸光度值。

(4)

式中,M1是包衣前的種子質量，M2是包衣后振蕩前的種子質量，M3是振蕩后包衣種子質量。

1.2.5成膜劑對玉米種子發芽和苗期生長及菌株活性的影響試驗將玉米種子浸泡在75%乙醇中進行表面消毒，風干。用90%SA+10%PVA、60%SA+40%PV、30%SA+70%PVA和10%SA+90%PVA配比的成膜劑助劑對玉米種子進行包衣(比例根據成膜時間而定)，最后置于兩層浸濕濾紙的發芽盒內，常溫培養。每個處理10顆種子，3個重復。7 d后，計算發芽率；14 d后，測量根長、莖長、葉長、葉寬，并計算種子活力指數(viability index，VI)[9]。

VI=(莖長+根長)×發芽率

(5)

將4個配比的成膜劑助劑溶液與稀釋100倍的發酵液按照體積比1∶1混合均勻，密封放于37 ℃培養箱中5 d，以無菌水與稀釋10倍的發酵液1∶1混合液為對照，通過稀釋平板計數法計算活菌數，以活菌下降率判斷成膜劑助劑對菌株活性的影響。

活菌下降率=

(6)

1.2.6生物種衣劑的制備及其對玉米種子及苗期的影響將90%SA+10%PVA配比的成膜劑助劑溶液中，加入TXM-1和TXM-2菌液，配制BSCA-1和BSCA-2生物種衣劑。具體如下：稱取各原料，先將成膜劑和增稠劑放入容器中，加入一定量無菌水，沸水浴直至溶解成粘稠狀，冷卻至40～50 ℃；再加入除菌劑外的其他原料，混合攪拌均勻；最后加入107cfu·mL-1的TXM-1、TXM-2菌液，充分混合攪拌均勻。將玉米種子表面消毒10 min，置于超凈臺中風干。按照藥種比1:10稱取種衣劑和種子，倒入燒杯中，搖動燒杯手動包衣，至種子表面顏色均勻，晾干。

將包衣種子播種于花盆中，每盆10粒，每個處理3次重復，以未包衣種子為對照。分別在第3、7 d，計算發芽勢、發芽率和種子活力指數，14 d測定根長、根數、莖長、地上株高、植株鮮重和干重。

1.3 數據分析

采用SPSS 23.0 對測定數據進行差異顯著性分析，用Origin 8.5 進行數據處理和繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同拮抗菌株對病原菌的影響

研究發現，6株菌種有明顯抑菌效果，分別為芽孢桿菌TXM-1、TXM-3、TXM-4、TXM-5、TXM-2和木霉TXMT-3(表1)，效果最好的是TXM-2，抑菌率達到23.11%，6個菌株對病原菌的抑制作用表現為 TXM-2>TXM-3>TXMT-3>TXM-5>TXM-4>TXM-1。

表1 不同菌株對病原菌的抑制結果Table 1 Inhibitory effect of different strains on pathogenic bacteria

2.2 菌株的促生效果

有研究顯示菌株的促生特性與其產IAA能力有關[10]，鐵載體具有生物防治作用[6]，篩選結果(圖1)發現，有抑菌效果的TXM-1、TXM-2、TXM-3、TXM-4、TXM-5、TXM-7共6個菌株均有產鐵載體和IAA能力，TXM-2的鐵載體活性最高，達到15.8個活性單位。TXM-1的IAA含量最高，為9.3 μg·mL-1。綜合菌株的抑菌作用和促生效果，選擇TXM-2解淀粉芽孢桿菌和TXM-1貝萊斯芽孢桿菌進行進下一步研究。

注：圖中不同小寫字母表示差異在P<0.05水平顯著。Note: Different lowercase letters in the figure indicate significant differences between different treatments at P<0.05 level.圖1 不同菌株的促生生理特性Fig.1 Physiological activities of different strains

2.3 菌株濃度對玉米種子發芽的影響

由表2可知，不同濃度TXM-2和TXM-1菌液浸泡的玉米種子發芽率均顯著高于對照。稀釋100倍TXM-2處理的玉米種子發芽率較CK顯著提高了29%，200倍和400倍處理均顯著提高了40%；稀釋100、200和400倍TXM-1處理的玉米種子發芽率分別較CK顯著提高了60%、50%和64%。

TXM-2和TXM-1菌液處理的種子胚芽和胚根長度均較對照長。稀釋100、200倍TXM-2的胚芽長度分別較CK顯著提高了46%和25%，而稀釋400倍TXM-2處理的胚芽長度與CK無顯著差異。稀釋100、200和400倍TXM-2處理的玉米胚根長度分別較CK顯著提高了25%、61%、28%。稀釋100、200和400倍TXM-1處理的玉米種子胚芽分別較CK顯著提高了59%、38%、18%,胚根長度分別較CK顯著提高了30%、72%、64%。綜合來看，TXM-2和TXM-1的最佳稀釋濃度均為200倍，對玉米種子發芽有顯著的促生作用。

表2 不同濃度菌液處理的玉米種子發芽性狀Table 2 Germination indexes of maize treated with different concentrations of bacterial strains

2.4 成膜劑比例的確定

2.4.1不同配比成膜劑的理化性質從玻板的表面看出，海藻酸鈉與聚乙烯醇不同比例制作的成膜劑中，10%SA+90%PVA處理的氣泡較少，光學顯微鏡觀察也發現，其表面較平滑，沒有凹陷(圖略)。由表3看出，不同成膜劑的成膜時間均在10 min以內，包衣均勻度均在90%以上，包衣脫落率均在7%以內，成膜性能較好。通過三種性能的綜合評價，挑選了90%SA+10%PVA、60%SA+40%PVA、30%SA+70%PVA、10%SA+90%PVA四種配比用于進一步研究。

表3 不同比例成膜劑的理化性能Table 3 Physical and chemical properties of film forming agents with different proportions

2.4.2不同配比成膜劑包衣對玉米種子發芽及苗期生長的影響90%SA+10%PVA、60%SA+40%PVA、30%SA+70%PVA、10%SA+90%PVA及CK的成膜劑的包衣種子發芽率和活力指數結果(圖2)顯示，成膜劑包衣對于玉米種子的發芽率和活力指數沒有不利影響，60%SA+40%PVA、30%SA+70%PVA和10%SA+90%PVA成膜劑顯著提高了玉米種子的發芽率和種子活力指數，其中10%SA+90%PVA處理效果最佳，其發芽率較CK顯著增加19%，種子活力指數顯著提高79%。成膜劑包衣對玉米苗期生長有一定的促生作用(表4)。90%SA+10%PVA、30%SA+70%PVA和10%SA+90%PVA 處理的玉米根長較CK顯著增加；30%SA+70%PVA 處理的玉米莖長較CK顯著提高；60%SA+40%PVA和10%SA+90%PVA 處理的玉米葉長較CK顯著增加；不同處理的葉寬沒有顯著差異。可見，不同處理中，10%SA+90%PVA處理的根長和葉長均最高，分別較CK提高了32%、20%。

注：不同小寫字母表示同一指標不同處理間差異在P<0.05水平顯著。Note: Different lowercase letters of the same index indicate significant differences between different treatments at P<0.05 level.圖2 不同比例成膜劑包衣的玉米發芽率和種子活力指數Fig.2 Germination rate and seed vigor index of maize coated with different proportions of film forming agents

表4 不同比例成膜劑對玉米苗期生長的影響Table 4 Effects of different proportions of film forming agents on the growth of maize seedlings

2.4.3不同配比成膜劑對菌株活性的影響由表5可以看出，成膜劑的添加均引起TXM-1和TXM-2的活菌下降，且隨著成膜劑中PVA比例的增加，活菌下降率逐漸下降。其中10%SA+90%PVA成膜劑的活菌下降率最低，表明該比例可以較好地維持菌株活性，從而有利于種衣劑的貯藏。

2.5 BSCA-1和BSCA-2種衣劑對玉米種子及苗期的影響

由表6可知，BSCA-1和BSCA-2種衣劑處理的玉米種子發芽率、發芽勢、活力指數均較CK顯著提高，發芽率分別提高17%和13%。從苗期生長來看，與裸種相比，經BSCA-1種衣劑處理的玉米苗的根長、莖長、地上株高、鮮重和干重分別較CK顯著提高了43%、27%、19%、79%和78%；經種衣劑BSCA-2處理的玉米苗的根長、莖長、地上株高、鮮重和干重分別顯著提高了41%、27%、19%、73%和61%。未包衣的種子根系稀疏，包衣后的種子根系粗壯且茂密，表明包衣后對玉米種子有明顯的促生作用。

表5 不同比例成膜劑對活菌下降率的影響Table 5 Effects of different proportions of film forming agents on live bacterial decline rate of strains

3 討論

對玉米土傳病害的綜合防治一般分為化學防治和生物防治。使用化學農藥簡單高效，但是會對環境造成一定的影響。利用微生物防治病害成本低、無殘毒。而且這些有益微生物不僅能阻止病原菌的生長和侵入，還能在植物根際形成優勢菌群，促進植物生長。微生物作為生物種衣劑的有效成分，也是種衣劑制備的關鍵方向。本研究通過平板對峙試驗篩選到6株對玉米莖腐病病原菌均有較強抑制作用的菌株，分別為解淀粉芽孢桿菌TXM-2、解淀粉芽孢桿菌TXM-3、枯草芽孢桿菌TXM-5、短小芽孢桿菌TXM-4、貝萊斯芽孢桿菌TXM-1和里氏木霉TXMT-3，其中解淀粉芽孢桿菌TXM-2的抑菌效果最好。大多數生防菌是從土壤或者植株根際中分離，且對莖腐病病原菌有拮抗作用的細菌以芽孢桿菌為主，Li等[11]從玉米根際分離到一株能減少秸稈腐爛的芽孢桿菌BV23，其在禾本科植物上的抑菌作用最強，抑制66.2%菌絲生長，抑制86.7%孢子產生。真菌以木霉的效果較明顯，吳曉儒等[12]通過木霉菌不同顆粒劑配方來計算對玉米莖腐病的防效，并同時進行多個基地的田間試驗，結果表明木霉顆粒劑具有良好的生物防治效果及增產作用。這些生物菌劑的應用可以減少或者代替化學農藥的使用。

表6 生物種衣劑包衣對玉米種子發芽和苗期生長的影響Table 6 Effects of biological seed coating agents on seed germination and seedling the growth of maize

植物根際與其營養的吸收利用直接相關，產生植物激素(IAA)和鐵載體等生理活性物質與植物的根際營養密切相關[13]。有研究表明鐵載體和吲哚乙酸可以修復被重金屬[14]和多環芳烴[15]污染的土壤，因而它們也具有修復土壤的潛力，是有較好應用前景的生物制劑。本研究通過促生生理指標的測定篩選到6株具有產鐵載體和IAA能力的菌株，其中TXM-2和TXM-1兩株菌的含量均較高，并且通過種子發芽試驗，驗證了其對種子發芽及幼苗生長的促進作用。結合抑菌作用和促生生理活性的比較，選擇具有抑菌和促生功能的TXM-2和TXM-1菌株。

成膜劑是種衣劑的重要部分，其決定了種衣劑產品的包衣性能[16]。聚乙烯醇能形成表面光滑、強韌的膜。海藻酸鈉中大量的羥基和羧基可與聚乙烯醇的羥基形成氫鍵，從而形成性能較好的混合膜，并且還具有促進種子萌發的作用[17]。膨潤土作為種衣劑的助劑，本身表面含有大量的羥基，與海藻酸鈉也會形成氫鍵作用[18]。本研究發現，作為種衣成膜劑成分，90%SA+10%PVA處理的玉米種子發芽和苗期生長最佳，菌株TXM-1和TXM-2的活性下降率最低。因此，成膜劑90%SA+10%PVA具有協同促生和減緩菌株活性下降的作用。從目前玉米的生物種衣劑研究現狀來看，芽孢桿菌、木霉菌、黃曲霉等菌株均可作為活性成分。張婷[19]將以木霉菌為活性成分的種衣劑應用于玉米種子中，對于玉米出苗和生長有明顯的促進作用，并且對根腐病有較好的防治效果。Cesare 等[20]研究的玉米種衣劑活性成分由不產黃曲霉毒素的黃曲霉菌株和兩種傳統農藥復合而成，發現該種衣劑能夠降低玉米粒中黃曲霉毒素的含量。本研究結合菌株的抑菌和促生特性，確定以貝萊斯芽孢桿菌TXM-1和解淀粉芽孢桿菌TXM-2分別為活性成分配制而成的兩種生物種衣劑BSCA-1和BSCA-2，具有良好的促進玉米種子發芽能力；結合盆栽試驗發現，這兩種生物種衣劑在保證拮抗病原菌生長的同時，還可促進玉米的苗期生長，然而還有待大田試驗進一步驗證。基于微囊劑能更好地保護生防菌免受環境影響[21]，將微囊劑添加到玉米生物種衣劑中從而延長生防菌活性維持時間，值得進一步研究。