PAK5/β-catenin信號通路在乳腺癌細胞多藥耐藥中的作用及機制

鞏嬋嬋，李艷青，展 瑞，湯 穎，陸夏良

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，發病率以每年0.2%～8%的幅度上升，嚴重威脅女性身心健康[1-2]。腫瘤細胞多藥耐藥的產生是導致乳腺癌治療失敗的主要原因之一，因此，研究乳腺癌細胞耐藥的分子機制，對發現新的治療靶點具有重要意義[3]。PAK5是p21激活激酶(p21-activated kinase, PAK)家族中的成員之一[4]。研究表明，PAK5可通過調控NF-κB促進乳腺癌細胞增殖，并參與乳腺癌細胞侵襲、遷移過程[5]。此外，PAK5還參與了肝癌細胞及食管鱗狀細胞癌對順鉑的耐藥[6-7]，PAK5表達可使卵巢癌細胞對紫杉醇產生耐藥[8]。因此，PAK5很可能參與了腫瘤細胞的耐藥進程，而PAK5在乳腺癌細胞耐藥中的機制仍不清楚。本實驗旨在驗證PAK5在乳腺癌細胞產生耐藥中的作用，并探討PAK5對β-catenin通路的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料人乳腺癌細胞BT-549、MDA-MB-231購自中國科學院細胞所。RPMI-1640培養基購自美國GIBCO公司，L-15培養基、CCK-8細胞增殖試劑盒購自凱基生物公司；無支原體胎牛血清購自中國杭州四季青公司；胰酶購自美國Sigma公司；抗PAK5抗體購自美國Abcam公司，β-catenin抗體購自Santa Cruz公司，PAK5過表達質粒購自上海艾博思生物公司。PAK5干擾序列購自上海吉瑪基因公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自南京碧云天公司；X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent轉染試劑購自Roche公司。

1.2 細胞培養與耐藥株誘導乳腺癌細胞株BT-549、MDA-MB-231分別于含10%胎牛血清的RPMI-1640、L-15培養基中，加入適量青霉素-鏈霉素溶液(雙抗)，在含5%CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養。取對數生長狀態良好的BT-549和MDA-MB-231細胞常規胰酶消化后，離心棄上清，后重懸取約106個細胞接種于含阿霉素(ADR，初濃度0.02 μg/mL)、紫杉醇(PTX，初濃度為0.2 μg/mL)的培養基中，待細胞存活狀態穩定后，不斷提高藥物濃度，直到其IC50值至少達到親本細胞IC50值的10倍以上，并能在RPMI-1640(L15)培養液中穩定地生長，持續傳代。后定期給予一定濃度的阿霉素或紫杉醇，間斷刺激。

1.3 CCK-8細胞增殖實驗胰酶消化對照組與實驗組(耐藥細胞株為實驗組時，其對應的親本細胞株為對照組；PAK5過表達組為實驗組時，其對照組為轉染空載質粒組；干擾PAK5組為實驗組，其對照組為干擾無關序列組)。向96孔板每孔鋪5×103個細胞。一豎排鋪5個孔，每孔為含10%FBS完全培養基稀釋的細胞100 μL；將鋪好細胞的96孔板，分別加藥后，置于細胞培養箱中分別培養24、48、72、96 h；將添加CCK-8檢測液的96孔板再放入培養箱中繼續孵育0.5、1、2、4 h；在相應的4個時間點拿出96孔板置酶標儀450 nm處測定相應孔的OD值。

1.4 克隆形成實驗將對照組和實驗組進行細胞消化計數，在6孔板中加入含10%FBS完全培養基3 mL，同時每行3個孔為一組，細胞數分別為100、300、500，實驗孔細胞數與其相對應，分別加藥后，將6孔板放入培養箱中培養。定期進行細胞換液，觀察10～14天，當培養皿中出現肉眼可見的克隆時，即終止培養。棄去培養基，用PBS緩沖液浸洗后吸出；加入4%多聚甲醛固定15 min，后棄固定液，加適量結晶紫(或Giemsa)染色10～30 min，空氣干燥；將各孔置于白色背景下拍照，最后進行統計學分析并作出統計圖。

1.5 Western blot法收集對照組和實驗組細胞，用RIPA裂解液充分裂解。按試劑盒方法提取總蛋白，將各組樣品配平，以配制成同體積同濃度同質量的樣品。按SDS聚丙烯酰胺凝膠制備分離樣品，NC膜進行轉膜(濕轉)，5%脫脂牛奶封閉，孵育一抗(PAK5，稀釋比1 ∶1 000；Actin，稀釋比1 ∶5 000)4 ℃過夜；將NC膜取出，室溫復溫30 min，Washing buffer洗膜；孵育二抗，室溫條件下2 h，Washing buffer漂洗NC膜，滴加ECL發光液，顯色。

1.6 細胞免疫熒光定位對照組與實驗組細胞生長至80%～90%融合度后，接種于鋪有蓋玻片的6孔板內，待親本細胞融合度達70%時開始轉染；耐藥株細胞不作轉染處理，培養24 h后，吸出原有培養基，加入提前預冷的4%多聚甲醛，室溫條件下固定15～20 min；后加入0.5%TritonX-100，室溫下孵育10 min；5%BSA封閉1 h(勿洗)；孵育一抗(β-catenin，稀釋比1 ∶100，用5%BSA作稀釋液)，4 ℃過夜；次日取出6孔板，于室溫條件下復溫30 min；孵育二抗(稀釋比1 ∶200，用5%BSA作稀釋液)，注意避光操作；后進行核染色；完成后取出蓋玻片，略晾干，封片。熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.7 羅丹明實驗對照組與實驗組細胞生長至約70%融合度時，用含2%羅丹明的完全培養基培養，置于37 ℃溫箱中30～50 min，后棄去培養液，PBS漂洗，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.8 免疫共沉淀提取對照組和實驗組細胞總蛋白，BCA測蛋白濃度；分為三個樣品組：Input(80 μg)、對照組(1 mg)、實驗組(1 mg)；實驗組加抗PAK5蛋白抗體(5 μg)，對照組加兔源IgG，4 ℃過夜；Input組存放于-20 ℃冰箱。實驗組及對照組加proteinA/G珠子(約30 μL)，4 ℃條件下旋轉混合2～4 h；將對照組與實驗組4 ℃離心，去上清，后用Western及IP細胞裂解液洗3遍(每次1 mL)，2 000 r/min離心1 min；加30 μL的2×Loading buffer，煮沸15 min；4 ℃，12 000g離心15 min，取上清；將所取樣品及Input組進行Western blot實驗。

2 結果

2.1 構建乳腺癌耐藥細胞模型選擇兩種常見的人乳腺癌細胞株BT-549和MDA-MB-231，阿霉素或紫杉醇小劑量濃度遞增法建株，成功構建BT-549耐阿霉素細胞株(BT-549/ADR)、BT-549耐紫杉醇細胞株(BT-549/PTX)、MDA-MB-231耐阿霉素細胞株(MDA-MB-231/ADR)和MDA-MB-231耐紫杉醇細胞株(MDA-MB-231/PTX)。為進一步驗證構建的乳腺癌耐藥株細胞的耐藥能力，將4種耐藥株細胞分別加藥培養后進行CCK-8細胞增殖實驗，結果顯示，與親本細胞相比，耐藥細胞株在24、48、72、96 h時細胞增殖均明顯升高(P<0.001，圖1)。同時，將4種耐藥株細胞加藥培養后進行克隆形成實驗，結果顯示，與親本細胞株相比，耐藥細胞株能形成大量的細胞集落，差異有統計學意義(P<0.001，圖2)。上述實驗表明，與親本細胞相比，耐藥細胞的增殖能力明顯增強。

圖2 克隆形成實驗檢測乳腺癌耐藥細胞株的克隆形成能力：A.BT-549/ADR；B.BT-549/PTX；C.MDA-MB-231/ADR；D.MDA-MB-231/PTX

2.2 PAK5對乳腺癌細胞耐藥株的影響Western blot法檢測耐藥細胞株中PAK5表達情況，結果顯示，與親本細胞相比，耐藥細胞株中PAK5蛋白表達增加(P<0.001，圖3)。乳腺癌細胞株中PAK5過表達，CCK-8實驗結果顯示，與對照組相比，PAK5過表達組的細胞增殖能力明顯增強(P<0.001，圖4)。乳腺癌細胞株中分別過表達PAK5和干擾PAK5，依次加藥后，采用CCK-8細胞增殖實驗檢測其IC50值，與對照組相比，PAK5過表達組的IC50值明顯增加，而PAK5干擾組的IC50值則明顯降低(表1)。在乳腺癌細胞株中過表達PAK5后行羅丹明染色，結果顯示，與對照組相比，PAK5過表達組的熒光強度更弱；對乳腺癌親本細胞及其耐藥株進行羅丹明染色，結果顯示，與親本細胞相比，耐藥株細胞中的熒光強度更弱(圖5)。上述實驗結果提示，PAK5可以促進乳腺癌細胞產生多藥耐藥，且可能是通過影響其耐藥蛋白的表達。

表1 乳腺癌細胞株BT-549和MDA-MB-231不同處理條件下的IC50值

圖3 Western blot法檢測乳腺癌耐藥細胞株中PAK5的表達：1. BT-549;2.BT-549/ADR;3.BT-549/PTX;4.MDA-MB-231;5.MDA-MB-231/ADR;6.MDA-MB-231/PTX; 與乳腺癌親本細胞株相比，***P<0.001

圖4 PAK5可促進乳腺癌細胞的增殖：A.BT-549；B.MDA-MB-231；與對照組相比，***P<0.001

2.3 PAK5對β-catenin信號通路的影響乳腺癌細胞中過表達PAK5后行細胞免疫熒光實驗觀察β-catenin表達，結果顯示，與對照組相比，PAK5過表達組中β-catenin表達明顯增加，且以細胞核內增加為主(圖6)。同時，親本細胞株與耐藥細胞株的免疫熒光結果顯示，與親本細胞株相比，耐藥細胞株中β-catenin表達顯著增加(圖6)。為進一步探究PAK5與β-catenin的關系，本實驗行免疫共沉淀實驗，結果顯示PAK5可以與β-catenin相結合；與親本細胞株相比，在耐藥細胞株中的結合增加(圖7)。上述實驗結果顯示，PAK5可以與β-catenin結合，且促進其表達。

3 討論

化療在乳腺癌綜合治療中起著不可替代的作用，但往往會由于腫瘤細胞產生多藥耐藥，導致化療無效或逐漸轉為無效，嚴重影響患者的生存質量和生存率[9-10]。因此，尋找腫瘤細胞產生耐藥的分子機制，可能為乳腺癌臨床的治療提供新的潛在作用靶點。PAK5是PAK家族中的成員之一，在多種腫瘤的發生、發展中起重要作用，而PAK5在乳腺癌細胞耐藥中的作用仍有待于進一步研究。

本實驗通過阿霉素及紫杉醇小劑量濃度遞增法構建4種乳腺癌耐藥株細胞，與親本細胞株相比，耐藥細胞株的細胞增殖能力增加，這些結果證實，構建的耐藥細胞株具有穩定的耐藥能力。此外，Western blot實驗表明，PAK5在耐藥細胞株中表達增加；CCK-8實驗顯示，PAK5過表達可促進乳腺癌細胞增殖。羅丹明123(Rhodamine 123)是一種可透過細胞膜的陽離子熒光染料，可以作為一種熒光指示劑，在耐藥細胞株中被作為細胞內底物泵出細胞外，而使細胞內的熒光減弱。該實驗結果表明，與親本細胞相比，耐藥細胞株中的耐藥蛋白表達增多；且PAK5可影響乳腺癌細胞中耐藥蛋白的表達。Wnt/β-catenin信號轉導通路在多種癌癥的發生、發展中起重要作用，Wnt信號通路激活后可抑制β-catenin的降解及磷酸化，導致其在細胞質或細胞核內的含量蓄積，啟動與癌癥相關的基因轉錄。細胞免疫熒光結果顯示，在乳腺癌細胞中過表達PAK5，β-catenin的表達也增加，且以細胞核的增加為主；同時，與親本細胞株相比，耐藥細胞株中β-catenin表達也是增加的。免疫共沉淀結果證實，PAK5與β-catenin結合，且在耐藥細胞株中的結合增加。以上結果表明，PAK5可促進乳腺癌細胞產生耐藥，且可能是通過結合并促進β-catenin的轉錄活性實現的。

β-catenin是Wnt信號通路的核心調控因子，與腫瘤的發生、發展密切相關[11-12]。本實驗揭示了PAK5通過β-catenin參與乳腺癌細胞耐藥的產生，為臨床乳腺癌患者耐藥的治療提供了新的理論依據。

圖5 羅丹明實驗檢測PAK5對乳腺癌細胞中耐藥蛋白表達的影響：A、B.細胞株BT-549和MDA-MB-231中分別過表達PAK5；C、D.羅丹明實驗觀察乳腺癌細胞系BT-549、MDA-MB-231及其耐藥株中熒光的強弱

圖6 細胞免疫熒光染色觀察β-catenin的表達變化：A、B.細胞株BT-549和MDA-MB-231中β-catenin的表達；C、D.乳腺癌細胞系BT-549和MDA-MB-231及其耐藥株中β-catenin的表達

圖7 免疫共沉淀實驗檢測PAK5與β-catenin的關系：A.在乳腺癌細胞株BT-549中，PAK5可與β-catenin結合；B.在耐藥株中PAK5與β-catenin結合增加