SS18陽性滑膜肉瘤中ALK及C-met的表達及其臨床意義

陳少華，曾德華，曲利娟，鄭智勇，陳一峰，歐陽小娟，王旭洲，許存寶，吳春林

滑膜肉瘤是一種少見的惡性間葉源性腫瘤，患者總體預后不良，尤其是難以根治切除、晚期復發或轉移者[1]。間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)及間質表皮轉化因子(cellular-mesenchymal to epithelial transition factor, C-met)均屬于酪氨酸激酶受體家族成員，其過表達常與腫瘤晚期相關，提示患者預后不良[2-3]。目前，ALK及C-met的研究和臨床應用更多局限于惡性上皮性腫瘤，如非小細胞肺癌等[4]，國內外對惡性間葉源性腫瘤的研究少見[5-8]，尤其是滑膜肉瘤。本實驗擬通過免疫組化、FISH、RT-PCR檢測ALK及C-met在滑膜肉瘤中的表達，探討其與臨床病理特征及預后的相關性，以期為指導臨床治療和預后評估提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集福建醫科大學附屬第二醫院、中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院及福建醫科大學附屬泉州市第一醫院病理科2006年6月～2019年6月經病理確診的82例滑膜肉瘤，并制成組織微陣列，經SS18 FISH檢測共篩選出陽性38例。收集38例SS18陽性滑膜肉瘤的臨床病理及隨訪資料，其中有5例為術后復發，其余術前均未進行任何相關治療，治療方案均為腫瘤切除，部分輔以淋巴結清掃。38例患者中失訪2例，另36例患者隨訪時間5～143個月，中位隨訪時間44個月。本實驗獲福建醫科大學附屬第二醫院倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

1.2 組織微陣列復習82例滑膜肉瘤HE切片，選取代表性區域(圖1)，采用Quick-Ray組織微陣列系統，從供體蠟塊中抽取典型腫瘤組織2個點，移至預制受體蠟塊(2.0 mm直徑，6×10位點)相應孔內，以正常肝組織為起始標記點，制成組織微陣列蠟塊；行4 μm厚連續切片，制成可供FISH檢測及免疫組化染色使用的組織微陣列數張。手動組織微陣列儀Quick-Ray(型號UATM-272)及預制受體蠟塊均購自韓國UNITMA公司。

1.3 免疫組化免疫組化染色在Ventana全自動免疫組化染色機中完成，并設置陽性及陰性對照。一抗兔抗人ALK單克隆抗體(D5F3，工作液)購自Ventana Medical Systems公司；鼠抗人ALK單克隆抗體(5A4，工作液)購自福州邁新公司；兔抗人C-met單克隆抗體(SP44，工作液)購自北京中杉金橋公司。

1.4 FISH將相應組織切片經常規脫蠟至水，熱水浴，蛋白酶K消化，10%中性福爾馬林固定，梯度乙醇脫水，加相應探針混合液(SS18、ALK、C-met)，雜交儀85 ℃變形，42 ℃雜交過夜，NP-40/SSC洗滌，70%乙醇洗片，干燥，加DAPI復染劑，封固。SS18(SYT)基因檢測試劑盒購自北京金菩嘉公司。ALK及C-met基因檢測試劑盒均購自Abbott Molecular公司。

1.5 RT-PCRALK(D5F3)蛋白高表達者組織5 μm厚切片10張，烤片后按HE切片劃定的腫瘤區域，用無菌刀將組織刮入1.5 mL EP管中。RNA提取試劑盒提取RNA后，用人類EML4-ALK融合基因試劑盒在AMx3000P測序儀上檢測。具體操作步驟參考試劑盒說明書。RNA提取試劑盒及人類EML4-ALK融合基因試劑盒，均購自廈門艾德生物公司。

1.6 結果判讀

1.6.1FISH判讀 SS18及ALK易位：計數100個腫瘤細胞，>15%的細胞核顯示紅綠信號分離，且大于信號寬度2倍以上，判為基因易位，否則為陰性。C-met擴增：計數100個腫瘤細胞中Met和CEP7信號的數量，若Met/CEP7比值≥2.2，則為陽性；若Met/CEP7比值<2.2，但平均Met拷貝數≥5.0，亦為陽性；若Met/CEP7比值<2.2且平均Met拷貝數<5.0，則為陰性。

1.6.2免疫組化評分 ALK定位在細胞質，C-met定位在細胞質/膜。按染色細胞百分率計分：<1%為0分；1%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分；按細胞染色強度計分：無陽性染色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。將兩項評分相乘作為最終評分：0分為陰性，1～3分為弱陽性，4～7分為中度陽性，>7分為強陽性；中度陽性及強陽性定義為高表達。所有結果均經2位病理醫師獨立評估，意見不一致病例在多頭顯微鏡下共同協商確定。

1.6.3RT-PCR判讀 EML4-ALK結果判讀具體參考人類EML4-ALK融合基因試劑盒說明書。

1.7 統計學方法采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，利用χ2檢驗和Fisher確切概率法分析ALK(D5F3)及C-met表達與臨床病理特征及預后的關系。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 滑膜肉瘤中SS18基因的表達82例滑膜肉瘤的組織微陣列經SS18 FISH檢測，共篩出38例SS18信號分離病例(圖2)。

2.2 SS18陽性滑膜肉瘤的臨床病理特征38例SS18陽性滑膜肉瘤患者年齡8～72歲，平均41歲；發生于四肢23例(60.5%)；軀干15例(39.5%)，其中肺及腎臟各2例，腹膜后1例；原發33例(86.8%)，復發5例(13.2%)。根據FNCLCC分級系統及第8版AJCC分期標準進行組織學分級及TNM分期，其中5例復發腫瘤未進行組織學分級及TNM分期，肺及腎臟共4例無明確TNM分期標準，故組織學分級Ⅰ級0例，Ⅱ級19例(57.6%)，Ⅲ級14例(42.4%)；TNM分期Ⅰ期0例，Ⅱ期14例(48.3%)，Ⅲ期15例(51.7%)。

2.3 SS18陽性滑膜肉瘤中ALK和C-met蛋白表達及與臨床病理特征、預后的關系38例SS18陽性滑膜肉瘤中，ALK(D5F3)陽性7例(18.4%)，其中6例弱陽性，1例強陽性(圖3)，高表達率為2.6%(1/38)。ALK(5A4)均為陰性(圖4)。C-met陽性7例(18.4%)，其中3例弱陽性，3例中度陽性，1例強陽性(圖5)，高表達率為10.5%(4/38)。ALK/C-met高表達者4例，其中ALK+/C-met+者1例，ALK-/C-met+者3例(表1)。C-met表達與組織學分型、組織學分級差異有統計學意義(P<0.05，表2)，而在患者性別、年齡、部位、腫瘤直徑、核分裂數、臨床分期和預后，差異無統計學意義，但高表達者病死率或轉移率達75%(3/4)。ALK(D5F3)表達在各臨床病理特征上差異均無統計學意義，但唯一高表達者發生肺轉移。ALK(D5F3)與C-met兩者表達無明顯相關性(r=0.124，χ2=0.588，P=0.383)。

2.4 ALK及C-met基因檢測唯一ALK(D5F3)蛋白高表達者ALK FISH檢測見ALK基因易位(腫瘤細胞約20%)(圖6)，但EML4-ALK RT-PCR為陰性。4例C-met蛋白高表達者C-met FISH均為陰性(圖7，表1)。

①②③④⑤⑥⑦

3 討論

近年來，針對ALK/C-met靶點的研究及其靶向藥物的臨床應用已在眾多惡性上皮性腫瘤中取得重大進展，在間變性大細胞淋巴瘤及神經母細胞瘤中也證實有效果，但對惡性間葉源性腫瘤的研究及臨床試驗仍少見，尤其是滑膜肉瘤。研究顯示，ALK及C-met蛋白在橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤及未分化肉瘤中均有一定陽性率，且均有少量ALK及C-met FISH陽性病例存在[5-8]。此外，炎性肌纖維母細胞性腫瘤、腺泡狀軟組織肉瘤，惡性外周神經鞘膜瘤、尤因肉瘤等也存在ALK蛋白及ALK FISH陽性病例[7,9-12]；而透明細胞肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤等也存在C-met蛋白及C-met FISH陽性病例[6,13]。文獻有報道少量ALK/C-met蛋白陽性滑膜肉瘤，但進一步行C-met FISH檢測較少，總之ALK易位或C-met擴增滑膜肉瘤病例罕見[6-7]。本實驗在較大宗基因確診滑膜肉瘤病例中對ALK及C-met表達情況進行探討。

表2 SS18陽性滑膜肉瘤中ALK及C-met表達與臨床病理特征及預后的關系[n(%)]

本實驗結果顯示，C-met在滑膜肉瘤中陽性率為18.4%(7/38)，其表達在組織學分型、組織學分級差異有統計學意義，提示：(1)陽性組中雙相型明顯多于單相型，并觀察到5例雙相型陽性病例中上皮成分均有表達，僅1例同時表達少量梭形細胞成分；(2)陽性組中組織學分級Ⅲ級明顯居多，而在臨床分期及預后差異無統計學意義，但觀察到75%(3/4)高表達者出現死亡或轉移，提示C-met陽性患者預后欠佳。ALK(D5F3)在滑膜肉瘤中陽性率為18.4%(7/38)，其表達與各臨床病理特征差異無統計學意義，且其與C-met表達無明顯相關性。本實驗還檢測ALK(5A4)蛋白，但結果均為陰性，故對滑膜肉瘤ALK蛋白初篩，建議選用克隆號D5F3更為合適。

本組中ALK/C-met蛋白高表達者僅4例，其中ALK+/C-met+者1例，ALK-/C-met+者3例。ALK+/C-met+者免疫表型為ALK(D5F3)彌漫強陽性、C-met多灶中度陽性；ALK FISH陽性提示腫瘤細胞存在ALK基因易位，但EML4-ALK RT-PCR陰性提示ALK基因不與EML4基因發生融合；C-met FISH未見C-met擴增；該患者于術后36個月發生肺轉移。3例ALK-/C-met+者C-met FISH均未見C-met擴增。Fleuren等[14]研究顯示ALK蛋白在14%(6/43)滑膜肉瘤中表達，6例陽性腫瘤僅1例顯示ALK易位，而C-met蛋白陽性率超過50%，但未進一步行C-met FISH檢測，且未對該組病例進行相關臨床病理分析。本實驗ALK陽性率與Fleuren等[14]研究結果基本一致，但C-met蛋白陽性率明顯偏低。

文獻報道克唑替尼、TAS-115等作為ALK/C-met靶點的雙重酪氨酸激酶抑制劑，對體外和體內ALK/C-met依賴的滑膜肉瘤細胞均具有抑制生長作用[14-15]，且以往文獻及本實驗均顯示ALK及C-met在滑膜肉瘤中有一定陽性率，提示ALK/C-met可能是該亞型的潛在治療靶點，但尚未見ALK/C-met抑制劑針對該亞型治療的相關臨床試驗?？诉蛱婺嵩谘仔约±w維母細胞性腫瘤患者靶向治療中有明顯療效[11]，個別晚期上皮樣炎性肌纖維母細胞肉瘤患者可獲得明顯緩解[12]，但其腫瘤組織中均可檢測到ALK蛋白表達及基因易位；而對橫紋肌肉瘤及透明細胞肉瘤卻均未觀察到明顯臨床客觀反應，文獻報道多數病例可檢出ALK/C-met蛋白表達，但未能檢測到ALK易位或C-met擴增，或未闡述基因檢測情況[13]。因此，作者建議針對ALK/C-met靶點的滑膜肉瘤臨床試驗適應者篩選，不應僅有ALK/C-met蛋白表達，更應有分子基因檢測確認；無蛋白及基因檢測結果者，不建議應用該類靶向藥物治療。

綜上，對滑膜肉瘤ALK蛋白初篩，選用克隆號D5F3更為合適。滑膜肉瘤中C-met蛋白更常表達于雙相型上皮細胞成分及組織學分級高者，ALK/C-met高表達者預后欠佳。ALK及C-met在滑膜肉瘤中有一定陽性率，提示ALK/C-met可能是該亞型的潛在治療靶點。