侵襲性纖維瘤病中CTNNB1基因突變與復發的相關性

陳修文，羅森源，湯顯斌，王鐵延，王 莉，黃育剛

侵襲性纖維瘤病又名韌帶樣型纖維瘤病或韌帶樣瘤，是一種發生于筋膜、肌腱膜或深部軟組織的纖維性腫瘤，由纖維母細胞和肌纖維母細胞過度增生形成。目前認為該病為中間性腫瘤，由于腫瘤周圍界限不清，常向周圍鄰近組織浸潤性生長，不易切除干凈，極易復發[1]。已有文獻報道[2]，β-catenin蛋白核陽性和CTNNB1基因突變可用于侵襲性纖維瘤病與其它梭形細胞病變的輔助鑒別診斷，而兩者與侵襲性纖維瘤病局部復發的關系在國內少見報道。本實驗收集32例CTNNB1突變陽性侵襲性纖維瘤病，分析β-catenin蛋白表達和CTNNB1分子病理改變情況，探討其與侵襲性纖維瘤病局部復發的聯系，為臨床評估該疾病復發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料收集2010年～2019年十堰市太和醫院病理科確診的侵襲性纖維瘤病32例，其中復發病例只納入第1次術后樣本。納入標準：(1)病灶組織病理學證實為相應的病理類型；(2)所有病例均進行CTNNB1基因突變檢測證實為突變陽性；(3)無其他惡性腫瘤病史。排除標準：(1)只有細胞病理學(如穿刺細胞學)診斷依據；(2)臨床資料不全。所用樣本均有至少1名高年資病理醫師復片，同時記錄臨床相關信息，包括發病年齡、性別、腫瘤大小、原發腫瘤部位等，并對所有病例進行隨訪，記錄復發情況。

1.2 免疫組化及結果判讀所有樣本均經10%中性緩沖福爾馬林固定、常規脫水、石蠟包埋、3 μm厚切片，HE染色，顯微鏡下觀察。免疫組化染色采用EnVision兩步法。抗原修復方法為Ttrs-EDTA (pH 9.0)高壓蒸汽修復。所用一抗為鼠抗人β-catenin單克隆抗體(UMA4B5，北京中杉金橋公司)，以PBS代替一抗作為陰性對照。結果判讀參照文獻[3]，β-catenin以細胞核著色判為陽性，同時陽性細胞數比例>10%判讀為陽性。

1.3 CTNNB1基因突變檢測采用FFPE組織DNA提取試劑盒(天根生化北京公司，DP331-02)提取組織樣本DNA。選取腫瘤組織>30%，腫瘤細胞含量>200個的蠟塊，5 μm厚連續切片10張，放入滅菌EP管中，二甲苯脫蠟后嚴格按照試劑盒說明書進行操作。使用VeritiTM DX PCR儀擴增CTNNB1基因3號外顯子目的片段，引物由生工生物上海公司合成，上游引物序列5′-TCCAATCTACTAATGCTAATACT GTTTCGTA-3′，下游引物5′-GCAAAAAGTTTTCCTGTTATC CA-3′，長度為308 bp。PCR反應體系為2×Reaction Mix 12.5 μL，上下游引物(10 μM)各1 μL，Golden DNA Polymerase 0.2 μL，DNA模板2 μL，RNase-free Water 8.3 μL，總體系25 μL。擴增條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共40個循環；最終72 ℃延伸5 min。PCR產物交由生工生物(上海)公司武漢測序部進行測序，測序結果與基因組DNA序列進行比對，參考序列為NM_001904.3。

1.4 統計學方法所有數據采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。對分類資料比較采用χ2檢驗或精確Fisher概率法；采用局部無復發生存率(local recurrence free survival, LRFS)評估復發狀態，其中生存資料起點為手術日期，終點為術后腫瘤第1次復發時間，生存分析描述采用Kaplan-Meier法，組間比較采用Log-rank檢驗，生存曲線繪制采用Graphpad prism。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征32例侵襲性纖維瘤病中男性6例，女性26例，男女比為1 ∶4.3。年齡4～65歲，平均34歲，中位年齡32歲。腫瘤發生部位：腹壁者12例，皆為女性，其中4例有明確剖宮產史，1例有闌尾炎手術史；腹腔內及腸系膜者5例，其中男性3例，女性2例，1例有多發子宮肌瘤病史；腹壁外者15例，其中男性3例，女性12例。腫瘤最大徑1.5～15 cm，平均7.5 cm，中位數7.5 cm。隨訪截至2020年4月20日，隨訪時間6～93個月，中位隨訪時間29個月，平均42個月，其中6例失訪，未失訪病例中未出現患者死亡，其中復發10例，復發時間在術后6～44個月。

2.2 病理檢查眼觀：腫瘤切面多為灰白色，實性質韌，與周圍界限不清(圖1)。鏡檢：可見梭形細胞條束狀增生，由纖維母細胞和肌纖維母細胞組成(圖2)，部分細胞排列也可呈波浪狀(圖3)，病灶周圍可見梭形肌纖維母細胞向周圍肌肉組織穿插，可見多核肌巨細胞(圖4)。免疫表型：32例侵襲性纖維瘤病中β-catenin核陽性病例占84.4%，多伴有胞質陽性(圖5)，部分病例未出現核表達(圖6)。

2.3 分子檢測結果32例CTNNB1突變陽性侵襲性纖維瘤病中，T41A 21例(圖7)，S45F 4例(圖8)，S45P 4例(圖9)，S33P 1例(圖10)，S33T合并G34R 1例(圖11)，A39_G48del 1例(圖12)。不同CTNNB1突變位點與β-catenin蛋白表達無明顯相關性(P>0.05，表1)。同時發現5例β-catenin陰性但CTNNB1基因突變陽性病例，其中3例T41A、1例S45P、1例S45F皆存在不同程度胞質陽性，1例出現胞核陽性，但比例<10%。

2.5 預后分析Kaplan-Meier結果顯示，不同CTNNB1突變類型之間LRFS差異有統計學意義(P<0.05，圖13)，而不同年齡、腫瘤最大徑、腫瘤原發部位、β-catenin蛋白表達水平中LRFS差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 侵襲性纖維瘤病中β-catenin蛋白表達與CTNNB1基因突變情況

2.4 CTNNB1基因突變與侵襲性纖維瘤病臨床病理特征的關系在侵襲性纖維瘤病中，不同CTNNB1基因突變類型中患者年齡、性別、發病部位、腫瘤大小差異均無統計學意義(P均>0.05，表2)。

表2 CTNNB1基因突變與侵襲性纖維瘤病臨床病理特征的關系

臨床病理參數nCTNNB1基因突變T41S45其它突變類型P值性別 男63210.477 女261862年齡(歲) ≤352011720.198 >35121011部位 腹壁12651 腹壁外1510320.416 腹腔內及腸系膜5500腫瘤直徑(cm) ≤583410.110 >5241842

①②③④⑤⑥

圖7 侵襲性纖維瘤病中CTNNB1基因T41A突變

圖8 侵襲性纖維瘤病中CTNNB1基因S45F突變

圖9 侵襲性纖維瘤病中CTNNB1基因S45P突變

圖10 侵襲性纖維瘤病中CTNNB1基因S33P突變

圖11 侵襲性纖維瘤病中CTNNB1基因S33T合并G34R突變

圖12 侵襲性纖維瘤病中CTNNB1基因A39_G48del突變

3 討論

侵襲性纖維瘤病是一種發生于深部軟組織，以纖維母細胞和肌纖維母細胞增生為主的疾病，伴有Wnt信號通路異常激活[1]。β-catenin作為經典Wnt信號通路的關鍵因子之一，已有文獻報道侵襲性纖維瘤病中存在β-catenin核高表達，同時該現象有助于侵襲性纖維瘤病的診斷和鑒別診斷[4]。但其它研究[5-6]發現β-catenin也可在其它腫瘤，如孤立性纖維性腫瘤、皮膚隆突性纖維肉瘤、子宮內膜間質肉瘤和滑膜肉瘤中出現一定程度核表達，尤其是需要鑒別診斷的梭形細胞腫瘤(如胃腸道間質瘤，低級別肌纖維母細胞肉瘤等)。因此，β-catenin核表達對于侵襲性纖維瘤病輔助診斷缺乏特異性，僅作為支持性依據。目前針對β-catenin免疫組化判讀缺乏公認標準，多數文獻以>10%的腫瘤細胞核著色判讀為陽性[3,7]，同時采用該標準判讀β-catenin的陽性率69.5%～91.7%。本實驗發現84.4%的侵襲性纖維瘤病中存在β-catenin核陽性，同時部分病例伴有胞質著色，與文獻報道一致。

圖13 不同CTNNB1突變位點的LRFS曲線

針對β-catenin免疫組化在侵襲性纖維瘤病輔助診斷中的缺點，Le Guellec等[2]針對254例侵襲性纖維瘤病和175例形態學上易與侵襲性纖維瘤病相混淆的梭形細胞病變，進行CTNNB1基因突變檢測，發現88%的侵襲性纖維瘤病中存在CTNNB1基因突變，而其它梭形細胞病變中未發現該基因exon3改變。相較于傳統的β-catenin免疫組化檢測，CTNNB1基因突變檢測具有更好的特異性，結果判讀更為準確和客觀。侵襲性纖維瘤病中CTNNB1基因突變類型以T41A最常見，其次為S45F、S45P，同時存在少量罕見突變類型，如T41I、G34A、S37A、S33T+G34A、S45C、D32G等[3,7]。本實驗選取CTNNB1突變陽性病例，發現其突變類型的分布與文獻報道一致，同時伴有S33P、S33T、A39_G48del等少見突變類型。近年有學者研究侵襲性纖維瘤病中β-catenin免疫組化檢測與CTNNB1基因突變的關系，發現不同免疫組化評判標準對兩者的一致性影響較大，當免疫組化以低強度染色(核陽性>1%或10%)為標準時，兩者差異無統計學意義[7-8]。采用本實驗判讀標準，不同基因突變類型中β-catenin免疫組化表達無明顯差異，與文獻報道一致。同時本實驗發現，部分病例CTNNB1突變陽性，而β-catenin免疫組化陰性，該部分病例都出現不同程度胞質陽性，考慮這部分病例雖然出現CTNNB1基因突變，致使β-catenin蛋白結構異常，與降解復合物解離，在細胞質中異常累積，但未累積到一定水平，導致并未出現明顯轉位入核的現象。

侵襲性纖維瘤病中不同CTNNB1基因突變分型與臨床病理特征的關系尚存在爭議。部分文獻發現S45作為一種獨立的突變類型，更容易發生在患者腹壁外部位，尤其是四肢末端[2,9]。Colombo等[10]認為S45突變類型更容易發生在腫瘤直徑較大的病例中。而van Broekhoven等[11]認為S45與腫瘤大小和發病部位無明確相關性。近期Koike等[7]對104例侵襲性纖維瘤病研究發現，不同CTNNB1基因分型與患者年齡、性別、腫瘤大小、發病部位無明顯相關性。本組未發現不同CTNNB1基因突變類型與臨床病理特征存在相關性，與部分文獻報道一致，考慮可能是由于納入S45突變類型的樣本量較低所致。

侵襲性纖維瘤病通常與周圍組織界限不清，常浸潤至鄰近軟組織，臨床上切除不凈極易復發，因此針對侵襲性纖維瘤病腫瘤局部復發的研究具有重要臨床價值。有學者認為CTNNB1基因突變型，尤其是S45F突變類型與侵襲性纖維瘤病患者復發密切相關[10-11]，同時仍有部分學者持相反觀點[12]。對于罕見突變類型位點如S33、G34等，與侵襲性纖維瘤病復發的關系卻少見報道。本組發現不同CTNNB1突變位點之間LRFS存在差異，可能是由于不同位點突變對β-catenin激活程度不一致所致，而β-catenin異常激活聚集又可以促進腫瘤細胞增殖[13]。相關基礎研究也發現存在S45F突變類型的侵襲性纖維瘤病細胞系更容易出現β-catenin細胞核聚集現象[14]。Rebouissou等[15]針對肝細胞腺瘤(hepatocellular adenomas, HCA)和肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的研究發現，在HCA/HCC中exon3缺失突變和D32-S37點突變導致β-catenin高強度激活，T41位點突變導致β-catenin中等強度激活，雖然S45導致β-catenin較弱的激活，但由于其等位基因的復制，導致β-catenin強表達。

綜上所述，本實驗結果顯示侵襲性纖維瘤病中存在β-catenin蛋白異常表達和CTNNB1基因突變等分子病理事件，同時CTNNB1基因突變位點可能是影響局部腫瘤復發的因素。但考慮本組納入CTNNB1基因突變的樣本量較少，計劃后續進一步加大樣本量進行驗證。