EDTA脫鈣在骨組織大切片制片中的應用效果

翁丹楓，傅曉丹，陳淑惠，張真真

骨腫瘤病理大切片可以觀察組織全貌，準確評估病灶大小、侵襲范圍以及手術切緣，對于確定骨腫瘤的邊界和臨床預后非常重要。但骨組織中豐富的鈣鹽導致完整制片困難，尤其是大切片的制作。普通酸性脫鈣液因破壞細胞及組織結構，影響染色、鏡下觀察和分子檢測，已不適用于日常工作，而EDTA脫鈣液性質溫和，能有效保護組織內的核酸和組織抗原，日益成為骨標本處理的首選[1-2]。本科室將EDTA脫鈣液應用于骨組織大切片制片及染色過程，總結了骨組織大切片的制作方法，以期在臨床骨病變標本的處理中推廣應用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑鋸骨機(昊鷹HYTW-300)，脫水機(Thermo Pathcenter)，多功能染色機(Leica ST5020)，磁力攪拌器(博大HMS-901)，恒溫搖床(南榮NRY-100C)，平推式切片機(REM-710，大和公司)，10%中性福爾馬林，不銹鋼包埋模具(6.5 cm×4.5 cm)、包埋脫水盒(6.5 cm×4.5 cm×1.0 cm)，載玻片(5.5 cm×5.1 cm)(圖1)，蓋玻片(5.5 cm×4.8 cm)。20%EDTA脫鈣液的配制：取乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na，購自上海瀘試化工公司，貨號6381-92-6)250 g于燒杯中，倒入磷酸鹽緩沖液至總體積1 000 mL；置于磁力攪拌器37 ℃恒溫攪拌，加入25 g氫氧化鈉繼續攪拌至完全溶解；測pH值為7.2～7.6。

1.2 取材與固定選取福建醫科大學附屬第一醫院病理科接收的股骨頭壞死和骨腫瘤標本20例，將骨組織標本用鋸骨機沿著矢狀面最大切面鋸開，鋸成大小4 cm×6 cm、2～8 mm厚的骨薄片，用10%中性福爾馬林室溫下固定24～48 h。

1.3 脫鈣固定好的骨組織切片完全浸沒于20%EDTA脫鈣液中，置于37 ℃恒溫搖床(HNY-100B，長沙巴躍儀器公司)，以60 r/min勻速緩慢搖動，期間每隔2天換脫鈣液，直至尖鑷較易刺入骨組織為脫鈣完成。

1.4 脫水與包埋將脫鈣后的骨組織放入大組織專用脫水機，針對不同厚度的組織選用相應的脫水程序(表1)，2～5 mm厚組織脫水時間為17 h，5～8 mm厚組織脫水時間為27 h。經58～60 ℃硬蠟包埋，包埋時將組織放在包埋框模具中，先向蠟槽加入一半石蠟，將組織放入蠟槽內，盡量居中壓平，輕力按壓一段時間后，蓋上包埋盒并灌加石蠟包埋，即制作成大蠟塊。

表1 骨大組織脫水流程中透明和浸蠟的時間

1.5 切片蠟塊整修后放入平推式滑動切片機上5～7 μm厚切片，45°角進刀。切片機可裝2個刀片，先用廢棄舊刀片修去表面余蠟，再換新刀片切出蠟片，要求切片厚度均勻，組織完整。因骨組織比較脆硬，切片時要緩慢、力度均勻，配上加濕器可使組織濕潤不易出現脆裂現象。經37 ℃蒸餾水和45 ℃溫水2次展片，攤片時應小心、輕柔且動作迅速，然后把蠟片撈于大載玻片上，瀝水晾干2 h后70 ℃烤片20～30 min，以防止染色過程中脫片。

1.6 HE染色將玻片斜插于染色架上(圖2)，后直接放入Leica ST5020全自動染色機中進行HE染色。

1.7 Masson染色切片脫蠟水洗，入鐵蘇木精5～10 min，0.5%鹽酸分化，流水至藍化，入酸性品紅5～10 min，磷鉬酸分化3～5 min，置于甲苯胺藍1 min，傾去染液，用1%冰醋酸洗，最后脫水、透明、封固。

①②

1.8 免疫組化采用免疫組化EnVision兩步法檢測CK、EMA和Ki-67在股骨頸大切片轉移癌中的表達，抗體及試劑盒均購自福州邁新公司，一抗工作濃度為1 ∶100，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

2 結果

骨組織7～10天脫鈣完成，經EDTA脫鈣后的骨組織脫鈣充分，軟硬適中，完全脫水，切片完整。HE染色顯示：股骨頭壞死(圖3A、B)和硬化型骨肉瘤(圖3C)大切片HE著色均勻，組織完整無鈣鹽殘余，無脫落和皺縮。骨肉瘤和股骨頭壞死灶內細微結構：包括藍色幼稚骨組織(圖4A)，紅色股骨頭壞死，藍色壞死周圍膠原(圖4B)，肉芽組織背景中微血管增生(圖4C)，提示大切片Masson染色有助于幼稚骨樣組織的識別、股骨頭壞死灶影像及病理的對比觀察和各種物質的量化評估。股骨頭轉移癌大組織切片免疫組化結果顯示：EDTA脫鈣對癌組織EMA(圖5A)、CK(圖5B)和Ki-67(圖5C)在染色強度和范圍無顯著影響，提示EDTA脫鈣大組織切片有助于保持細胞胞膜、胞質及胞核的抗原。

3 討論

骨大組織切片可以突破小切片的局限性，能夠在同一張切片中觀察整個骨病變的細微結構，完整顯示骨質破壞的范圍和程度，反映骨組織周圍軟組織的變化，整體性強，有利于骨病變的病理診斷及預后判斷。但是前期骨標本脫鈣是骨組織大切片制作的難點和關鍵。EDTA是一種優良的脫鈣螯合劑，其脫鈣作用優于酸性溶液，對組織破壞極小，能保持組織細胞的完整結構，尤其細胞顯微化學改變甚微，且能保存組織中抗原物質的活性，在免疫組化方面具有較大優勢[2]。研究表明EDTA脫鈣液用于大鼠脛骨組織脫鈣時間需3周以上[3]，無法滿足臨床快速診斷需要。適當提高EDTA脫鈣液濃度和溫度能夠縮短脫鈣的時間[4-5]，因此我們采用濃度為20%EDTA脫鈣液，并且脫鈣過程始終在37 ℃恒溫搖床中進行，通過恒溫加熱及震蕩加速脫鈣液滲入組織。結果表明，脫鈣時間縮短至1周，節省了脫鈣時間并提高工作效率，且HE、Masson和免疫組化染色結果顯示其對骨大組織細微結構及組織內酶類和抗原保存良好。

本組通過多次實驗摸索，總結EDTA脫鈣制備骨病變大切片的方法：(1)骨組織大切片的取材厚度2～3 mm為佳，太厚則影響組織的固定、脫鈣和脫水效果，太薄組織經脫水和浸蠟后易變形，包埋時組織不平整，切面不完整，較難完整制片；(2)組織固定、脫鈣和脫水時間要充足，為確保骨組織充分脫鈣和脫水，脫鈣液每隔1天要更換，組織脫水處理所用試劑須根據使用情況及時更新，保持有效濃度，脫水完全可以防止掉片；(3)脫鈣完成后經流水沖洗15 min，防止殘余EDTA在乙醇和組織中沉淀，影響組織染色；(4)浸蠟溫度以62～65 ℃為宜，建議用熔點為58～60 ℃的硬蠟，溫度太高會使組織細胞變形變脆，核皺縮，切片易皺縮脫落，組織塊容易龜裂；而溫度太低則影響液態石蠟向組織的浸透，組織浸蠟不充分影響切片；(5)包埋要平整，對組織翹起部分，可使用按壓工具，待底層石蠟凝固后，輕輕蓋上包埋盒再灌注石蠟，可防止氣泡，包埋時的冷凍時間也需要嚴格控制，凍至蠟塊表面發白后轉移至常溫放置；(6)切片時要勻速進刀，過快或過慢刀口均容易卡住蠟塊，且不需要冷凍蠟塊，但需要使用加濕器消除靜電[6]，切片后室溫晾干1 h以上，再放入烤箱70 ℃烤片30 min再行后續染色；(7)行特殊染色和免疫組化染色時需制作上膠片：普通載玻片涂沫粘附劑如多聚賴氨酸或APES稀釋后用丙酮浸泡，再過乙醇、蒸餾水，最后烤干待用，可防止掉片。

③A③B③C④A④B④C⑤A⑤B⑤C

綜上所述，在37 ℃下20%EDTA脫鈣用于制作骨大組織切片的方法簡便易行，耗時短，且染色符合形態學觀察要求，適用于臨床和科研對骨組織大標本的形態學觀察、影像學比對、骨腫瘤化療效果、骨壞死程度和范圍的評估，為骨病變的分子檢測奠定基礎，值得推廣使用。