福爾馬林固定石蠟包埋標(biāo)本二代測序終文庫去除引物二聚體的方法

許 潔，張科平，林丹義，陳 潔，朱小蘭，駱新蘭

二代測序(next generation sequencing, NGS)技術(shù)能夠同時(shí)對上百萬乃至數(shù)十億個(gè)DNA分子進(jìn)行測序，相較于傳統(tǒng)測序技術(shù)，其速度較快、一次可檢測大量靶基因，因而廣泛應(yīng)用于染色體非整倍體無創(chuàng)產(chǎn)前篩查、腫瘤靶向治療基因突變檢測、遺傳性腫瘤檢測、病原微生物及宏基因組檢測等領(lǐng)域。影響NGS結(jié)果的限制性因素包括：平臺類別、靶區(qū)域富集方法、文庫構(gòu)建及擴(kuò)增效率、測序數(shù)據(jù)量、生物信息學(xué)分析流程等。NGS流程主要包括3個(gè)部分：文庫制備、測序和數(shù)據(jù)分析，建庫是NGS實(shí)驗(yàn)第一步，終文庫質(zhì)量的好壞直接影響后續(xù)測序儀上機(jī)實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析。目前常用的建庫方法有雜交捕獲和擴(kuò)增子建庫，無論哪種建庫方法都會運(yùn)用PCR方法，引物二聚體是PCR實(shí)驗(yàn)過程中引物的3′端間相互錯(cuò)配擴(kuò)增形成的，若終文庫引物二聚體含量高，占用測序數(shù)據(jù)量，直接影響測序數(shù)據(jù)質(zhì)量。如何有效去除引物二聚體，同時(shí)不影響終文庫質(zhì)量，是眾多實(shí)驗(yàn)者考慮的問題，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用AMPureXP beads對福爾馬林固定石蠟包埋標(biāo)本終文庫引物二聚體進(jìn)行純化，得到較滿意的結(jié)果，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑石蠟標(biāo)本DNA提取試劑盒QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(德國，Qiagen，56404)，人多基因突變檢測通用試劑盒(燃石醫(yī)學(xué)，RS03F-12)，人多基因突變檢測捕獲探針-朗克(燃石醫(yī)學(xué)，RS010-12，V3)，人多基因突變檢測捕獲探針-凱康(燃石醫(yī)學(xué)，RS032-12，V2)，DNA 1000 Reagents(Agilent，5067-1504)，QUBIT dsDNA HS Assay(Life，Q32856)，AMPureXP beads(Beckman，A63882)，人類EGFR基因突變檢測試劑盒(廈門艾德生物公司，8.0120201 W012B)，人類KRAS基因突變檢測試劑盒(廈門艾德生物公司，8.0120102W006B)；高通量測序儀(美國，Illumina，MiSeqDx)，生物分析儀(美國，Agilent，2100)，核酸定量儀(美國，Life，Qubit 4.0)，熒光定量PCR儀(美國，Roche，LightCycler480)。

1.2 標(biāo)本來源選取廣東省人民醫(yī)院病理科2019年9～11月存檔的41例福爾馬林固定石蠟包埋標(biāo)本，均為手術(shù)大標(biāo)本，其中24例結(jié)直腸癌，17例肺癌，男性24例，女性17例，平均年齡(54.83±10.51)歲。

1.3 方法

1.3.1DNA提取 10 μm厚組織切片8張，切片貼于干凈的玻片上。二甲苯脫蠟至水后，按照HE染色片所選取的腫瘤區(qū)域，小心用無菌刀片將腫瘤組織刮入1.5 mL EP管中。應(yīng)用石蠟組織DNA抽提試劑盒QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取DNA。

1.3.2NGS建庫實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用人多基因突變檢測通用試劑盒建庫，根據(jù)不同癌種選擇不同探針建庫(肺癌選用朗克，結(jié)直腸癌選用凱康)。最后得到20 μL終文庫，對其進(jìn)行質(zhì)控：使用核酸定量儀(美國，Life，Qubit 4.0)對其濃度進(jìn)行定量，使用生物分析儀(美國，Agilent，2100)對其片段進(jìn)行評估，此建庫方法加接頭文庫FFPE DNA的片段主要分布在300～500 bp。

1.3.3終文庫引物二聚體去除 挑取其中12例引物二聚體峰高度超過主峰1/3高度的終文庫，使用AMPureXP beads(Beckman，A63882)對其進(jìn)行純化：加入1.8倍終文庫體積的XP磁珠，將文庫DNA片段與磁珠結(jié)合，用70%的乙醇洗2次磁珠(吸附DNA片段)，去除污染物，最后加入初始體積一半的溶解緩沖液(elution buffer， EB)即 10 μL 溶解純化后的文庫，對該純化后的終文庫進(jìn)行質(zhì)控：使用核酸定量儀對其濃度進(jìn)行定量，使用生物分析儀對其片段進(jìn)行評估。

1.3.4NGS上機(jī) 根據(jù)MiSeqDx高通量測序儀標(biāo)準(zhǔn)操作流程操作，對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控。

1.3.5運(yùn)用突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(amplificationrefractorymutationsystem,ARMS)-PCR驗(yàn)證 使用廈門艾德生物公司的EGFR及KRAS突變檢測試劑盒對12例終文庫使用AMPure XP beads純化的標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證，ARMS-PCR實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按試劑說明書操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

12例終文庫經(jīng)過純化，2100生物分析儀結(jié)果顯示，均有效去除引物二聚體，且主峰位置、主峰熒光響應(yīng)值變化不大，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1，圖1)，核酸定量儀對其濃度進(jìn)行定量，均在可實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.420，P=0.120，P>0.05，表1)，上機(jī)數(shù)據(jù)質(zhì)控通過，使用ARMS-PCR法對EGFR基因和KRAS基因常見突變進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果相符。

表1 終文庫二次純化前、后濃度及主峰位置、熒光響應(yīng)值對比，主要質(zhì)控參數(shù)及測序結(jié)果

圖1 (例9)樣本終文庫純化前后生物分析儀2100電泳結(jié)果圖：A.純化前；B.純化后

3 討論

NGS可以利用少量樣本獲得多基因、多位點(diǎn)的突變信息，并利用這些突變信息為患者選擇合適的靶向治療，同時(shí)發(fā)現(xiàn)更多未經(jīng)報(bào)道的新的基因突變類型，為新的靶向藥物研發(fā)提供依據(jù)[1]。通過多基因檢測可以實(shí)現(xiàn)在病程早期接受特異的針對性治療，減少毒副作用，提高治療效果，對臨床加快有效篩選目標(biāo)人群有重要意義[2]。影響NGS實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素很多，本實(shí)驗(yàn)采用國家藥品監(jiān)督管理局(NMPA)批準(zhǔn)的建庫試劑盒，遵照相關(guān)技術(shù)規(guī)范，使得樣本預(yù)處理至文庫構(gòu)建、測序、質(zhì)控的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，形成一套NGS技術(shù)可行性SOP。測序文庫的質(zhì)控是標(biāo)準(zhǔn)化流程的第一步，如果文庫質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)差，應(yīng)及早終止實(shí)驗(yàn)。在常規(guī)病理診斷中，腫瘤標(biāo)本通常以福爾馬林固定石蠟包埋形式加以保存，其會引起DNA的片段化以及交聯(lián)反應(yīng)[3]。基于石蠟組織本身的特性，在建庫過程中難免會形成引物二聚體，影響終文庫質(zhì)量，如何有效去除引物二聚體，保證有效測序數(shù)據(jù)量的產(chǎn)出是福爾馬林固定石蠟包埋樣本建庫必須考慮的問題之一。作者發(fā)現(xiàn)引物二聚體峰一般出現(xiàn)在100 bp以內(nèi)，采用AMPureXP法可以提取大于100 bp PCR產(chǎn)物，去除小于50 bp的引物，故而本實(shí)驗(yàn)選用AMPureXP試劑，根據(jù)說明書建議，加入1.8倍終文庫體積的XP磁珠，考慮到實(shí)驗(yàn)過程中會有損耗，使用初始體積一半量的EB溶解純化后的文庫，生物分析儀電泳結(jié)果圖顯示，該方法可以很好地去除終文庫引物二聚體，核酸定量儀測定純化后與純化前的文庫濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于有效數(shù)據(jù)量及數(shù)據(jù)比對情況對分析結(jié)果準(zhǔn)確性影響較大，所以在數(shù)據(jù)分析之前，需要對數(shù)據(jù)產(chǎn)出量、比對情況、測序深度、覆蓋度及測序均一性等指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以確定數(shù)據(jù)的質(zhì)量及分析結(jié)果的可靠性[4]。序列回貼比率是指成功比對回到參考基因組的序列數(shù)目占比，可以反映數(shù)據(jù)的比對情況，12例文庫的序列回貼比率均達(dá)到100%；測序深度是指目標(biāo)基因每個(gè)堿基被測到的次數(shù)，是評價(jià)測序質(zhì)量的指標(biāo)之一，有效測序深度是指去除PCR重復(fù)讀取之后的深度，80%以上的目標(biāo)捕獲區(qū)域應(yīng)達(dá)到這個(gè)深度，中國腫瘤驅(qū)動基因分析聯(lián)盟(CAGC)建議，臨床腫瘤組織樣本的NGS檢測數(shù)據(jù)中測序有效深度應(yīng)達(dá)500倍以上[5]，本實(shí)驗(yàn)12例文庫的測序有效深度在508～1 171倍，滿足實(shí)驗(yàn)要求；插入片段長度是指DNA文庫插入片段長度的中位數(shù)，體現(xiàn)了原始DNA片段的長度分布，組織樣本如果<170 bp則提示DNA存在降解，可能會引入由于DNA損傷造成的假陽性，12例純化后的終文庫插入片段長度在179～262 bp，在可實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)。綜上所述，本組12例采用AMPureXP磁珠進(jìn)行純化的文庫相應(yīng)的測序數(shù)據(jù)質(zhì)控均通過，從側(cè)面證明該純化方法的可行性。利用ARMS-PCR法對12例經(jīng)過純化處理的終文庫EGFR、KRAS基因常見突變進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果幾乎完全符合，僅1例由于ARMS試劑將19種EGFR的19號外顯子缺失類型混合在1個(gè)孔進(jìn)行檢測，僅能檢出19號外顯子缺失而無法區(qū)分具體的缺失類型。

總之，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用AMPureXP beads對福爾馬林固定石蠟包埋標(biāo)本終文庫進(jìn)行純化，既可以很好地去除引物二聚體，又幾乎不影響測序質(zhì)量，筆者認(rèn)為可以在臨床推廣，提高NGS實(shí)驗(yàn)的成功率，避免重復(fù)實(shí)驗(yàn)，縮短報(bào)告時(shí)間，節(jié)約測序費(fèi)用，使得更多的患者受益。