石蠟包埋組織結核分枝桿菌檢測方法的對比分析

張繼偉，李欽麗，聶 秀

結核病是由結核分枝桿菌引起的極具危害性的肉芽腫性病變，以肺結核最為常見。目前，組織病理學檢查已成為結核病診斷的重要手段。抗酸染色作為結核病主要輔助檢查手段，其靈敏度、特異性均較低[1-2]。《中國結核病病理學診斷專家共識》提出結核病的病理診斷標準：根據結核病的病理變化及結核分枝桿菌基因檢測陽性才能作出明確診斷。文獻報道qRT-PCR法通過特異性擴增結核分枝桿菌的DNA，現已成為結核病的檢測手段[3-4]。然而，其在石蠟包埋組織結核分枝桿菌檢測中的應用較少，且各實驗室報道的陽性率差異較大[5-6]。本實驗采用qRT-PCR法進行結核分枝桿菌檢測，同時與傳統的抗酸染色進行比較，結果顯示qRT-PCR優于抗酸染色檢測，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2018年5月～2019年11月華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院病理科經病理擬診為結核病或符合結核的石蠟包埋組織1 218例，包括手術標本683例和活檢標本535例，其中男性716例，女性502例；年齡2個月～83歲，中位年齡50歲。病變組織種類詳見表1，其他包括乳腺、子宮腔、腕部、腹腔、胸壁腫物等組織標本159例。

1.2 主要儀器和試劑Mx3000P型熒光定量PCR儀(美國安捷倫公司)，石蠟包埋組織基因組DNA提取試劑盒(QIAGEN公司，德國)，結核分枝桿菌核酸定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)(湖南圣湘生物公司)，抗酸染色液(珠海貝索生物公司)。

表1 病變組織種類及抗酸染色和qRT-PCR法檢測

1.3 qRT-PCR檢測石蠟包埋組織5 μm厚連續切片，手術標本5片，活檢標本10片，置于1.5 mL EP管中，按照石蠟包埋組織基因組DNA提取試劑盒的操作說明書進行樣本DNA提取。樣本DNA的濃度及純度經紫外分光光度法檢測合格后，按結核分枝桿菌核酸定量檢測試劑盒說明書，進行樣本結核分枝桿菌檢測。樣本檢測時均設陽性對照和陰性對照。結果分析：目標基因的Ct參考值為39，內標的Ct參考值為40。對于測定Ct≤39的樣本，報告為結核分枝桿菌DNA陽性；對于測定Ct>39的樣本，同時內標檢測為陽性(Ct≤40)，報告注明結核分枝桿菌DNA低于試劑盒檢測下限，若內標Ct>40或無顯示，該檢測無效。

1.4 抗酸染色石蠟包埋組織3 μm厚連續切片，生物透明劑康萊脫蠟2次，每次5 min，去離子水沖洗2 min。滴加石炭酸復紅染液染色30 min，染色過程中注意觀察染液的液面。去離子水沖洗2 min；分化液分化3～4次，至切片呈無色為止，部分組織可呈淡粉色；去離子水沖洗2 min。亞甲基藍溶液復染10～30 s，去離子水沖洗2 min。常規脫水、晾干、封片。染色結果判讀：抗酸桿菌呈鮮紅色，紅細胞呈粉紅色，細胞核及背景呈淡藍色。

1.5 統計學方法采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計數資料采用例和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。采用Kappa檢驗比較兩種方法的一致性。

2 結果

2.1 抗酸染色和qRT-PCR法檢測結核分枝桿菌抗酸染色組織中呈亮紅色為結核分枝桿菌，長度3 μm左右(可有很大變化幅度)，呈纖細稍彎的桿狀或念珠樣成堆或散在分布，陰性為淺藍色背景下不能檢出亮紅色桿菌(圖1)。qRT-PCR檢測結核分枝桿菌內標曲線(藍色曲線)應升起且Ct值≤40，結核分枝桿菌特異性基因擴增曲線(紅色曲線)升起且Ct≤39為陽性，否則為陰性(圖2)。1 218例標本中抗酸染色陽性率為35.8%(436/1 218)，qRT-PCR檢測陽性率為51.2%(624/1 218)，差異有統計學意義(χ2=50.029，P<0.05，表1)。683例手術標本中抗酸染色陽性率為43.5%(297/683)；qRT-PCR檢測陽性率為58.4%(399/683)，差異有統計學意義(χ2=30.477，P<0.05)。535例活檢小標本中抗酸染色陽性率為26.0%(139/535)，qRT-PCR檢測陽性率為42.1%(225/535)，差異有統計學意義(χ2=54.058，P<0.05，表1，圖3)。其中病例數大于100例的肺、腸道、骨組織和淋巴結標本中，抗酸染色陽性率分別為44.4%、11.35%、30.7%和42.2%，qRT-PCR檢測陽性率分別為63.3%、14.59%、50.4%和55.04%(表1，圖4)。

AB

2.2 抗酸染色和qRT-PCR檢測結核分枝桿菌的一致性本組1 218例標本中，兩種方法檢測均陽性376例，均陰性534例，一致性為74.7%(κ=0.498，P<0.05，表2)。其中683例手術標本采用兩種方法檢測有261例均陽性，248例均陰性，一致性為74.5%(κ=0.501，P<0.05)；535例活檢標本采用兩種方法檢測均陽性115例，均陰性286例，一致性為75.0%(κ=0.458，P<0.05，圖5)。在病例數大于100例的肺、腸道、骨組織和淋巴結標本中，兩種方法檢測的一致性分別為69%、91.3%、74.05%和74.3%(圖6)。376例兩種方法檢測均陽性的標本中，qRT-PCR檢測的Ct值80%分布在24～36之間；在248例抗酸染色陰性而qRT-PCR檢測陽性病例中，qRT-PCR檢測的Ct值則80%分布在30～40之間(圖7)。

圖2 qRT-PCR法檢測結核分枝桿菌：A.陽性；B.陰性

圖3 抗酸染色和qRT-PCR法檢測手術標本和活檢標本中結核分枝桿菌的陽性率

表2 抗酸染色、qRT-PCR法檢測結核分枝桿菌一致性分析

3 討論

本實驗中抗酸染色和qRT-PCR檢測結核分枝桿菌的陽性率與文獻報道的結核分枝桿菌抗酸染色(31%～50.1%)和qRT-PCR檢測(50%～75.8%)結果基本一致[5-7]。本組對683例手術標本和535例活檢標本同時用兩種方法檢測，結果發現活檢標本抗酸染色和qRT-PCR檢測的陽性率為26.0%和42.1%，均顯著低于手術標本的抗酸染色(43.5%)和qRT-PCR檢測(58.4%)。活檢標本陽性率低于手術標本的主要原因：活檢標本組織量較少，大部分含菌量較低，經常規HE和免疫組化染色后損失較多，同時活檢標本前期組織處理不當更容易導致DNA降解，顯著影響結核分枝桿菌qRT-PCR檢測。因此，活檢標本進行結核分枝桿菌檢測時應盡量避免組織損失，且盡量用敏感性高的qRT-PCR法進行檢測。

圖4 抗酸染色和qRT-PCR法檢測不同組織標本結核分枝桿菌的陽性率

圖5 抗酸染色和qRT-PCR法檢測手術標本和活檢標本中結核分枝桿菌的一致性

圖6 抗酸染色和qRT-PCR法檢測不同組織標本中結核分枝桿菌的一致性

圖7 抗酸染色檢測結核分枝桿菌與qRT-PCR法檢測結核分枝桿菌Ct值分布：A.抗酸染色和qRT-PCR均陽性病例Ct值分布；B.抗酸染色陰性和qRT-PCR陽性病例Ct值分布

本組1 218例石蠟包埋組織中，對450例肺、185例腸道、127例骨組織和109例淋巴結標本，同時采用抗酸染色和qRT-PCR檢測結核分枝桿菌的陽性率，結果表明肺標本結核分枝桿菌采用抗酸染色(44.4%)和qRT-PCR(63.3%)檢測的陽性率均最高，其次為淋巴結(42.2%和55.04%)、骨組織(30.7%和50.4%)，而腸道標本為11.35%和14.59%。上述結果與結核病在不同組織的發病率一致，表明肺結核最常見。骨組織在標本處理過程中常需要進行脫鈣使組織軟化，以方便常規HE切片及進行后續的分子檢測。臨床病理中常用的脫鈣液為10%硝酸，可以迅速脫鈣、作用效果強，但同時對骨組織也會產生較大的破壞作用，導致標本DNA降解，直接影響qRT-PCR檢測結核分枝桿菌的陽性率。研究表明通過優化脫鈣骨組織DNA的提取方法，能夠增加qRT-PCR檢測結核分枝桿菌檢測的陽性率。此外，在實際工作中研究者發現，根據骨組織大小，嚴格控制脫鈣時間或更換脫鈣效果較溫和的脫鈣液，也能有效降低骨組織脫鈣導致DNA降解。

本實驗中抗酸染色和qRT-PCR檢測結核分枝桿菌一致性為74.7%，其中手術標本一致性為74.5%，活檢標本一致性為75.0%，表明兩種方法有較高的吻合性。為進一步明確兩種方法的一致性，本實驗分析了376例抗酸染色和qRT-PCR檢測均為陽性病例和248例抗酸染色陰性而qRT-PCR檢測為陽性病例的Ct值分布情況，結果表明376例抗酸染色陽性病例，qRT-PCR檢測Ct值80%分布在24～36之間；248例抗酸染色陰性病例，qRT-PCR檢測Ct值80%分布在30～40之間，與前者相比，Ct值顯著趨近于臨界值39。

在實際臨床工作中，為保證qRT-PCR檢測結核分枝桿菌結果的準確性和可靠性，應注意的是：(1)由于qRT-PCR靈敏度高，為防止污染的發生應盡量在標準的臨床基因擴增檢驗室中進行檢測；(2)檢測人員應該進行規范化培訓，并持有臨檢中心頒發的PCR上崗證；(3)檢測儀器設備和試劑應符合要求；(4)應避免樣品間產生交叉污染，在樣本制備過程中使用完全清潔的刀片、手套，選用結核分枝桿菌明確陰性的樣本與待檢測樣本同時制備和檢測；(5)為避免假陽性的發生，檢測結果應結合患者臨床癥狀及其他實驗室檢查結果進行綜合判斷。

綜上所述，在石蠟包埋組織結核分枝桿菌檢測方法中，與傳統的抗酸染色相比，qRT-PCR檢測方法具有敏感性高、特異性強等特點，對結核病的組織學病理診斷，尤其是活檢標本的病理診斷具有重要的應用價值，可顯著提高結核病的檢出率。由于qRT-PCR檢測可能出現假陽性或假陰性，為提高結核病的病理診斷準確性，應根據病理形態學改變并結合抗酸染色結果進行診斷。