瓊脂糖明膠在組織脫水前預包埋中的應用

時維平，史海磊，付廣明，趙樹超，戚慧陽，付海洋

優質的HE切片是病理診斷的前提條件，在病理工作中占據重要地位[1]。HE染色與諸多環節有關，組織包埋質量是其中重要的一環，正確的組織包埋是HE制片及診斷的基礎[2]。在日常工作中，雖然大部分組織均能被正確包埋，但仍會遇到一些問題，如細小、零碎的標本使用紗布或脫水紙進行包裹，脫水后易黏附在紗布或脫水紙上，包埋時無法進行完整剝離，造成人為標本丟失；特殊標本如內鏡黏膜下剝離術(endoscopic submucosal dissection, ESD)等脫水后需查找正確的包埋面，否則會出現診斷失誤；取材時某些組織與腫瘤或息肉粘連不緊密，脫水后易發生剝離或斷裂的現象，對診斷工作造成一定影響[3]。本科室經實驗發現，使用瓊脂糖明膠在脫水前對組織標本進行預包埋，脫水后不影響組織原固有形態，包埋省時、省力，對HE及免疫組化無影響，現介紹如下。

1 材料與方法

1.1 標本收集日常工作中息肉或腫瘤與組織粘連處較小的標本，如腫瘤與周圍組織粘連處較小、膽囊息肉等標本，以及ESD標本、婦科刮宮、腦科手術室等細小零碎的標本。

1.2 儀器櫻花VP1脫水機，Leica切片機，Roche HE 600單獨滴染染色機，DAKO全自動免疫組化機Link 48，冰箱，一次性藥碗，電熱恒溫箱，水浴箱。

1.3 試劑瓊脂糖購自上海藍季公司，明膠購自國藥集團，HE染色試劑為Roche HE 600染色套裝，CKpan一抗購自DAKO公司。

1.4 方法(1)配制瓊脂糖明膠：0.5 g瓊脂糖加入100 mL蒸餾水中，加熱至完全融化后放入60 ℃恒溫箱中備用。1 g明膠加入100 mL蒸餾水，加熱至完全融化后放入60 ℃恒溫箱中備用。使用時將兩者按1 ∶1進行混勻。(2)取材：先將一部分凝膠倒入一次性藥碗中，稍冷卻，然后放入組織定型，再倒入瓊脂糖明膠完全包被組織，置于冰箱中冷藏，1～2 min后瓊脂糖明膠冷卻成形，取出后進行修整，使其大小及厚度與包埋盒一致(圖1)。(3)包埋：組織脫水，透明，浸蠟。(4)HE染色：石蠟切片3 μm厚，65 ℃烘烤切片15 min，使用Roche HE 600染色機染色，染色模式設置為H2A2E4。(5)免疫組化染色：石蠟切片3 μm厚，65 ℃烘烤切片60 min，脫蠟水化后進行抗原修復，上機前打開試劑蓋檢查試劑是否充足，采用免疫組化EnVision法染色。

圖1 組織使用瓊脂糖-明膠進行預包埋：A.細小破碎的腦組織標本；B.肝腫瘤與周圍組織粘連的標本；C.胃組織的特定切緣面標本；D.胃鏡ESD標本

2 結果

本組經瓊脂糖明膠包裹的組織，脫水良好，組織原固有狀態保持完好，未發現剝離或斷裂現象。細小破碎的腦組織等標本，無需使用易黏附標本的紗布等包裹，包埋時也不會發生遺失現象，充分保證了組織的完整性。ESD或特定切緣面等標本進行包裹后，不會在脫水盒中發生位置偏移(圖2)，包埋時無需費時費力查找特定包埋面，組織-瓊脂糖明膠塊方便易取，可直接放入包埋底模中，省時、省力。經HE及免疫組化染色，組織形態保持完好，染色效果佳(圖3、4)。

②③④

3 討論

在日常工作中，經常遇到組織脫水后破裂或損傷的現象，包埋時遺失、組織包埋面不易確認等現象為后續的制片及診斷埋下隱患。楊洋等[4]報道的斜面包埋手法用于解決ESD組織包埋面的問題，其對包埋技巧及速度有一定的要求；曾曉蓓等[5]報道使用瓊脂作為細胞蠟塊的凝膠劑，本組將其應用于組織預包埋中，發現效果不理想，主要原因是瓊脂濃度太高、融化需要較長時間，太低凝形不成功，且濃度高低均對后續脫水有影響，不方便操作。

本實驗使用的瓊脂糖明膠較好的解決了上述問題。瓊脂糖與瓊脂相比，其結構和成分更單一，且生物安全性已得到廣泛證實[6]，其凝膠后具有一定的力學性能，如硬度、粘彈性等；而明膠作為一種凝膠劑，具有更低的液化點和凝固點。經過反復實驗，兩者單獨使用效果不佳，配合使用效果較好，一方面為了降低各自的濃度，達到降低融點、提高融化速度的目的，另一方面兩者配合增加凝固后的硬度，方便后續操作。經過瓊脂糖明膠預包埋的組織，既維持組織原始固有形態，又避免了組織在脫水包埋過程中的損傷或損失。對于息肉等細小的粘連性標本，可以維持其與組織的原始位置，不會發生剝離的現象；臨床送檢的細小零碎標本不會再出現粘連在紗布或脫水紙上，保證了取材標本的完整性；對于其他標本則節省了時間，提高了工作效率。我們對細胞蠟塊反復進行瓊脂糖明膠包埋實驗，發現其效果較好。另外，在對組織進行預包埋時，可以使用冰袋促使其凝固，便于組織在凝膠中定型。

瓊脂糖明膠在整個過程中僅僅起支撐作用，與細胞蠟塊的混合離心不同，未滲透至組織內部中，對HE、免疫組化及分子檢測等無影響。在使用瓊脂糖明膠對組織進行預包埋需要注意以下問題：(1)使用前進行瓊脂糖和明膠的混合，降低了融點，節約了時間；(2)組織固定后、脫水前進行預包埋，然后直接進入脫水程序，避免組織固定不佳或瓊脂糖明膠吸水膨脹導致脫水失敗；(3)瓊脂糖明膠包埋完成后進行適當修整，以免無法放入脫水盒中。