高效液相色譜法測定蟻參蠲痹膠囊中丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA的含量

楊 曼 張菁菁 閆春風(fēng) 董海榮▲

1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000；2.頸復(fù)康藥業(yè)集團有限公司，河北承德 067000；3.河北省中藥新輔料技術(shù)創(chuàng)新中心，河北承德 067000

蟻參蠲痹膠囊由頸復(fù)康藥業(yè)集團有限公司生產(chǎn)，臨床用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（中醫(yī)辨證為脾腎兩虛、寒濕瘀阻證）的常用中成藥。處方由螞蟻、人參、丹參等15 味中藥組成，具有祛風(fēng)除濕、補腎健脾、活血通絡(luò)的功效[1]。丹參[2]為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根及根莖，丹參酮類是其主要化學(xué)成分，具有良好的活血化瘀、祛瘀通絡(luò)功效，且研究表明丹參酮類化合物具有良好的抗炎功能[3-6]，在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中起重要的作用。蟻參蠲痹膠囊現(xiàn)行注冊標準只建立了丹參酮ⅡA的含量測定方法，為了更加全面地控制藥品質(zhì)量，本實驗建立高效液相色譜法同時測定制劑中丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA的含量，為更加全面地控制蟻參蠲痹膠囊質(zhì)量提供科學(xué)的依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent 高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；MS204TS 電子分析天平（萬分之一）；XSE205 電子分析天平（十萬分之一）；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

隱丹參酮（批號：110852-201807，供含量測定用）、丹參酮ⅡA（批號：110766-202022，供含量測定用），均購于中國食品藥品檢定研究院；丹參酮Ⅰ（批號：568-73-0，上海詩丹德標準技術(shù)服務(wù)有限公司，供含量測定用）；蟻參蠲痹膠囊（批號：920246B、020074、020261），為市售品；甲醇為分析純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水為自制純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent 5 TC-C18色譜柱（4.6mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇-0.02%磷酸溶液（75∶25）；檢測波長為270 nm；體積流量為1.0 mL/min；柱溫25℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取三種丹參酮類對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為16、5、15 μg/mL 的對照品混合溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品內(nèi)容物約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，超聲處理（功率150 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方中藥味比例和制備工藝，制備缺丹參陰性樣品，同“2.2.2”項下方法制備陰性樣品溶液即得。

2.3 專屬性試驗

分別取對照品、供試品及陰性樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，色譜圖見圖1，結(jié)果顯示，陰性無干擾，該方法專屬性良好。

圖1 高效液相色譜法色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取三成分對照品適量，置于同一棕色量瓶中，加甲醇制成每1 毫升含丹參酮ⅡA 200 μg、隱丹參酮200 μg、丹參酮Ⅰ50 μg 的混合對照品儲備液。

分別精密量取上述混合對照品儲備液4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 mL于10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，即得標準溶液。按“2.1”項下色譜條件測定，以待測成分質(zhì)量濃度（X）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標進行線性回歸，結(jié)果詳見表1。

表1 三種成分線性回歸方程和線性范圍

2.5 精密度試驗

吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜峰面積，結(jié)果顯示，丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA 的RSD分別為0.61%、0.29%、0.19%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

室溫下取供試品溶液（批號：920246B），分別于0、2、4、6、8、12、24 h 測定目標成分峰面積，計算丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA 的峰面積RSD分別為0.91%、0.43%、0.83%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一批樣品，按“2.2.2”項下方法制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，測得丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的含量對應(yīng)的RSD分別為2.21%、0.74%、0.81%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱定已知含量的蟻參蠲痹膠囊內(nèi)容物9 份，每份0.75 g，分別精密加入約相當于樣品含量50%、100%、150%的混合對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進液相分析，計算平均回收率及RSD值，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n=9）

2.9 樣品含量測定

取不同批號的樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定樣品含量，結(jié)果詳見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（n=2，mg/g）

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

在參照相關(guān)文獻[7-15]后，考察不同體系及不同比例的流動相（乙腈-0.02%磷酸、甲醇-水、乙腈-1%醋酸及乙腈-甲醇-水），經(jīng)比較采用流動相甲醇-0.02%磷酸（75∶25）等度洗脫時，隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA 的分離效果最好。并對各指標成分進行紫外全波長掃描，結(jié)果顯示，丹參酮Ⅰ、隱丹參酮及丹參酮ⅡA 分別在248、268、270 nm 處有最大吸收，參考相關(guān)文獻[16-18]并查閱《中華人民共和國藥典》2020版一部[2]中丹參藥材項下丹參酮類的含量測定，蟻參蠲痹膠囊中三個指標性成分在270 nm 處均有較大吸收，最終確定檢測波長為270 nm。由于篇幅所限，該色譜條件優(yōu)選過程前文并未全部列出。

3.2 方法學(xué)耐用性考察

考慮到所建立的方法應(yīng)具有耐用性，對不同流速、不同柱溫以及不同的色譜柱進行耐用性考察，結(jié)果顯示，在流速為0.8、1.0、1.2 mL/min 下，各指標性成分分離效果均較好，分離度與RSD值均達到要求。在柱溫為20、25、30℃下各指標性成分與相鄰雜峰的分離度均較好，丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA 含量測定的RSD值為3.97%、0.66%、2.74%，表明柱溫對丹參酮Ⅰ的含量測定有一定影響，因此在含量測定過程中要嚴格控制柱溫。依次考察了Agilent 5 TC-C18、Kromasil、Inertsil-ODS、YMC色譜柱，結(jié)果顯示，四種色譜柱分離效果均較好；另外還發(fā)現(xiàn)，使用Agilent 5 TC-C18與YMC 色譜柱時丹參酮Ⅰ先于隱丹參酮出峰，而換為Kromasil 與Inertsil-ODS 色譜柱后，丹參酮Ⅰ與隱丹參酮的出峰順序互換，由于篇幅所限，該方法學(xué)耐用性考察部分前文并未全部列出。

3.3 小結(jié)

本實驗采用高效液相色譜法同時測定蟻參蠲痹膠囊中的丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA的含量，經(jīng)方法學(xué)研究，結(jié)果表明該方法重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，回收率好，專屬性較強。本法操作簡單、結(jié)果可靠，為更好地控制蟻參蠲痹膠囊質(zhì)量提供參考。