外源性典型N-酰化高絲氨酸內(nèi)酯類化合物(AHLs)信號(hào)分子對(duì)污水處理過程N(yùn)2O產(chǎn)生的影響

閆 旭, 霍兆曼, 石博文, 黃佳駿, 郭 麗, 陳 純, 鄭仕侃, 楊 潔, 馬嘉暉, 蘇現(xiàn)伐, 孫劍輝

1.河南師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院, 黃淮水環(huán)境與污染防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南省環(huán)境污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南 新鄉(xiāng) 453007 2.河南省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心, 河南 鄭州 450046

氧化亞氮(N2O)是一種強(qiáng)溫室氣體，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，平均壽命長達(dá)116年[1-2]，其100年增溫潛勢為二氧化碳(CO2)的265倍，并且還能夠破壞臭氧層、促進(jìn)酸雨形成[3]. 城市污水處理廠由于在生物脫氮過程中能夠大量產(chǎn)生N2O而備受關(guān)注，每年通過污水處理廠釋放的N2O占全球人為釋放量的3.2%[4-5]，并且還以年均0.25%～0.31%的速率持續(xù)增長[6-7]. 如何在保證污水處理效率的同時(shí)減少N2O排放，已經(jīng)成為污水處理行業(yè)面臨的新挑戰(zhàn).

目前，污水處理工藝主要通過硝化和反硝化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)生物脫氮. 硝化反應(yīng)主要發(fā)生在好氧單元，反硝化反應(yīng)主要發(fā)生在厭氧或缺氧單元，理論上，硝化和反硝化過程均可能產(chǎn)生N2O[8-9]. 已有研究發(fā)現(xiàn)，低C/N、高pH、低污泥齡和低溫等運(yùn)行條件也能間接引起N2O產(chǎn)生[9-13]，其根本原因都是微生物對(duì)水質(zhì)和環(huán)境條件做出的響應(yīng).

長久以來，人們普遍認(rèn)為細(xì)菌是以單細(xì)胞形式存在的生物個(gè)體，生長代謝過程主要受到外界環(huán)境條件影響，相互間不存在信息交流和協(xié)作分工[14]. 但近些年研究發(fā)現(xiàn)，各種微生物之間能夠通過分泌自誘導(dǎo)物(Autoinducer)，也稱信號(hào)分子，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞間的通訊，控制其群體行為，這種細(xì)胞間的信息交流方式被稱為群體感應(yīng)(Quorum sensing)[15-16]. 群體感應(yīng)能夠通過自誘導(dǎo)物激發(fā)菌體內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，協(xié)調(diào)菌群生理行為，表現(xiàn)出單個(gè)個(gè)體細(xì)菌無法實(shí)現(xiàn)的生理功能和調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)微生物EPS的合成、群集運(yùn)動(dòng)、聚集生長、以及菌群增殖速度與世代長短等生理行為產(chǎn)生重要影響[17-18].

已有研究[19-22]發(fā)現(xiàn)，城市污水處理過程中的活性污泥中也有群體感應(yīng)信號(hào)分子存在. LI等[23]在活性污泥系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，投加N-?；呓z氨酸內(nèi)酯類化合物(AHLs)能夠提高活性污泥的粘附性、硝化效果和微生物生長速率，同時(shí)顯著影響EPS的含量和其中多糖、蛋白質(zhì)、脂類等成分組成. Mellbye等[24]研究了群體感應(yīng)對(duì)維氏硝酸桿菌(Nitrobacterwinogradskyi)的作用，發(fā)現(xiàn)群體感應(yīng)能夠顯著增加硝化過程中氮氧化物(NO、NO2和N2O)的產(chǎn)生和消耗速率，并且大幅提高關(guān)鍵功能基因nirK含量. 可見，信號(hào)分子對(duì)生物脫氮過程及微生物關(guān)鍵功能基因表達(dá)都具有重要影響. N2O產(chǎn)生于生物脫氮過程，與群體感應(yīng)現(xiàn)象具有潛在聯(lián)系，但目前關(guān)于信號(hào)分子對(duì)N2O產(chǎn)生的影響還缺乏深入研究.

選取兩種N-?；呓z氨酸內(nèi)酯類化合物(AHLs)信號(hào)分子C6-HSL(N-己酰L-高絲氨酸內(nèi)酯)和C8-HSL(N-辛酰-L-高絲氨酸內(nèi)酯)，綜合考察其外源性投加對(duì)AO工藝污水處理效果、N2O產(chǎn)生特征及微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，以期為污水處理廠高效脫氮和溫室氣體減排提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置和運(yùn)行條件

圖1為模擬裝置示意圖. 裝置的有效容積為2.4 L，上部密封僅保留氣體取樣口和廢水進(jìn)入口，下部留有曝氣口和污水取樣口. 一個(gè)反應(yīng)周期包括15 min進(jìn)水(1.2 L廢水)、120 min厭氧處理、390 min好氧處理、30 min沉淀和15 min出水，厭氧和好氧處理期間每間隔30 min,同時(shí)采集氣樣和水樣[25]. 該研究中厭氧段ρ(DO)控制在0.2 mg/L以下，好氧段ρ(DO)均控制在(2.0±0.2)mg/L.ρ(污泥)控制在 3 000 mg/L，為保持污泥處于懸浮狀態(tài)，采用磁力攪拌器(85-2型，上海司樂儀器有限公司)攪拌，攪拌器轉(zhuǎn)速為300 r/min；通過氣泵送風(fēng)曝氣，曝氣量根據(jù)ρ(DO)通過空氣流量計(jì)控制.

圖1 試驗(yàn)裝置示意Fig.1 Schematic diagram of experimental equipment

該文共運(yùn)行3個(gè)相同反應(yīng)器，接種污泥取自新鄉(xiāng)市小尚莊污水處理廠好氧池，運(yùn)行2個(gè)月反應(yīng)器穩(wěn)定后，其中兩個(gè)在進(jìn)水時(shí)分別投加信號(hào)分子C6-HSL和C8-HSL(Sigma-Aldrich)，c(C6-HSL)和c(C8-HSL)均為2×10-6mol/L，另一個(gè)反應(yīng)器為對(duì)照組.

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用水為某小區(qū)生活污水，ρ(CODCr)為(402.0±0.5)mg/L、ρ(NH4+-N)為(41.3±0.2)mg/L、ρ(NO3--N)為(0.85±0.20)mg/L、ρ(TN)為(44.2±0.4)mg/L.

1.3 N2O的氣體采樣

1.3.1厭氧段

厭氧段采樣方法參照YAN等[10]研究，采樣時(shí)通過密封的法蘭將集氣罩固定在反應(yīng)器頂部，每隔3 min氣樣從集氣罩頂部氣閥通過聚四氟乙烯管采集到50 mL的聚丙烯注射器中，然后通過三通閥進(jìn)入50 mL氣袋(LB-301-0.05，大連德霖氣體包裝有限公司)保存. 厭氧段液體表面的N2O釋放通量F1〔mg/(m2·min)〕通過式(1)(2)計(jì)算[10]：

(1)

(2)

式中：V為從液面到裝置頂部的體積，m3；A為裝置液面表面積，m2；ρ為試驗(yàn)裝置內(nèi)N2O密度，mg/m3；M為N2O的分子量，44.02 g/mol；P為大氣壓，1 atm(1 atm=101 325 Pa)；R為氣體常數(shù)，0.082 L·atm/(K·mol)；T為溫度，K；Δc/Δt為采樣期間裝置內(nèi)ρ(N2O)隨時(shí)間的變化，10-9min-1.

1.3.2好氧段

好氧段氣體采樣時(shí)，仍然通過集氣罩密封連接裝置，流出氣體通過聚四氟乙烯管收集到50 mL的氣體采樣袋中，每次采樣均采集3個(gè)平行樣品，好氧段液體表面的N2O釋放通量F2〔mg/(m2·min)〕通過式(3)計(jì)算[10]：

(3)

式中：c為采樣氣體的濃度，10-9；Qa為曝氣速率，m3/min.

1.4 樣品分析方法

該研究中ρ(CODCr)、ρ(NH4+-N)、ρ(NO3--N)、ρ(TN)和ρ(NO2--N)均按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定[26]，ρ(DO)和pH采用WTW340i型手持pH溶解氧測定儀(哈希水質(zhì)分析儀器有限公司)測定，N2O濃度采用配有6rNi的電子捕獲檢測器(ECD)的氣相色譜儀(Angilent-7890B, 美國安捷倫公司)進(jìn)行測定.

1.5 微生物群落結(jié)構(gòu)

采用DNA提取試劑盒(MO.BIO PowerSoilTM, USA)提取污泥樣品中總的DNA，使用16S RNA基因V3～V4區(qū)通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GG ACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，使用Gene AmpR PCR系統(tǒng)(9700, AB, USA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增. 試劑采用60 μL體系，包括10× Ex Taq Buffer 6 μL、dNTP 6 μL、BSA 0.6 μL、Ex Taq 0.3 μL、Primer F 1.2 μL、Primer R 1.2 μL、DNA 1 μL、補(bǔ)充dd H2O至43.7 μL. PCR反應(yīng)條件：擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，31個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，降溫至22 ℃結(jié)束. 最后將純化產(chǎn)物在Illumina MiSeq平臺(tái)(Illumina, San Diego, USA)進(jìn)行高通量測序. 以上微生物的測定與分析均委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成.

2 結(jié)果與討論

2.1 信號(hào)分子對(duì)處理效果的影響

圖2顯示了投加信號(hào)分子后污染物濃度在一個(gè)反應(yīng)周期內(nèi)的變化情況. 表1顯示了3個(gè)反應(yīng)器主要污染物的去除率. 3.反應(yīng)器CODCr去除率差異不大，均在93.0%以上，但投加C6-HSL和C8-HSL的反應(yīng)器中ρ(CODCr)在厭氧段下降明顯較快，這可能是由于投加信號(hào)分子加強(qiáng)了系統(tǒng)的反硝化作用，增加了有機(jī)物消耗. 含氮污染物(NH4+-N、NO3--N、NO2--N)在投加信號(hào)分子后濃度變化差異明顯.ρ(NH4+-N)在投加信號(hào)分子的反應(yīng)器中下降更快，表明硝化速率提高，NH4+-N去除率也比對(duì)照組分別提高了1.7%(C6-HSL)和2.2%(C8-HSL). 而TN去除率在投加C6-HSL和C8-HSL后分別提高了7.6%和5.4%. 另外，3個(gè)反應(yīng)器在厭氧和好氧處理階段都發(fā)生了不同程度的NO2--N積累現(xiàn)象，但投加信號(hào)分子后處理系統(tǒng)中出現(xiàn)的最高ρ(NO2--N)都顯著降低.

在污水生物處理過程中，信號(hào)分子與脫氮過程關(guān)系密切[13]. FENG等[22]研究外源性信號(hào)分子對(duì)硝化過程的影響時(shí)同樣發(fā)現(xiàn)，信號(hào)分子C6-HSL能明顯提高硝化污泥的氨氮降解速率. YU等[27]在對(duì)膜生物反應(yīng)器的研究中發(fā)現(xiàn)，AHLs類信號(hào)分子能夠顯著影響AOB的活性，進(jìn)而對(duì)水處理系統(tǒng)生物脫氮效率產(chǎn)生影響. 結(jié)合以上結(jié)果，表明C6-HSL和C8-HSL能夠強(qiáng)化污水硝化過程，同時(shí)提高反硝化效果.

圖2 信號(hào)分子對(duì)主要污染物濃度的影響Fig.2 Influence of signal molecules on removal of main pollutants

表1 信號(hào)分子對(duì)污水處理效果和N2O產(chǎn)生的影響

2.2 信號(hào)分子對(duì)N2O產(chǎn)生的影響

圖3顯示了一個(gè)反應(yīng)周期內(nèi)，投加信號(hào)分子對(duì)N2O逸散特征的影響. 由圖3可以看出，反應(yīng)器好氧段N2O釋放速率明顯高于厭氧段，投加信號(hào)分子的反應(yīng)器的釋放速率幾乎在整個(gè)反應(yīng)周期都高于對(duì)照組. 投加C6-HSL和C8-HSL后，反應(yīng)器內(nèi)N2O的釋放速率顯著升高，N2O總逸散量分別增加了39.0%和11.0%，N2O轉(zhuǎn)化率也由對(duì)照組的0.32%分別提高至0.46%和0.41%(見表1). 該研究中，N2O主要釋放于好氧段(見圖3、表1)，3個(gè)系統(tǒng)好氧段N2O釋放量分別占總量的76.54%、88.36%和88.08%. 盡管投加信號(hào)分子后厭氧段的絕對(duì)釋放量也有所增加，但好氧段增幅更加顯著.

圖3 信號(hào)分子對(duì)N2O產(chǎn)生特征的影響Fig.3 Effect of signal molecules on N2O production characteristics

3個(gè)反應(yīng)器中N2O釋放速率的變化規(guī)律均與ρ(NO2--N)一致，這是因?yàn)镹O2--N在硝化和反硝化過程中都是重要的中間產(chǎn)物[9]. 硝化過程中，NO2--N積累會(huì)誘發(fā)AOB發(fā)生反硝化作用，將NO2--N還原產(chǎn)生N2O[28]；反硝化過程中，N2O是一種必然出現(xiàn)的中間產(chǎn)物，由于反硝化過程中各種酶對(duì)電子的競爭能力不同，NO3--N還原酶競爭能力最強(qiáng)，而N2O還原酶對(duì)電子的競爭力較弱，因此NO2--N積累與N2O產(chǎn)生經(jīng)常同時(shí)出現(xiàn)[2,29]. 結(jié)合N2O產(chǎn)生速率的變化特征可以看出，硝化細(xì)菌反硝化是該研究中N2O產(chǎn)生的主要途徑.

圖4 信號(hào)分子對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effects of signal molecules on microbial community structure

2.3 信號(hào)分子對(duì)系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

圖4(a)顯示了門分類水平上優(yōu)勢菌群(相對(duì)豐度大于0.5%)在3個(gè)反應(yīng)器中的相對(duì)豐度. 投加信號(hào)分子后，WS6、Proteobacteria和Bacteroidetes的相對(duì)豐度顯著下降，其中投加C6-HSL的反應(yīng)器比對(duì)照組分別減少了12.4%、0.7%和0.5%，投加C8-HSL的反應(yīng)器比對(duì)照組分別減少了13.7%、7.7%和2.3%. 而Chloroflexi、Acidobacteria的相對(duì)豐度則在投加C6-HSL和C8-HSL后分別增加了2.2%、5.8%和3.3%、18.5%.

圖4(b)顯示了屬分類水平上優(yōu)勢菌群在投加信號(hào)分子后相對(duì)豐度的變化情況.norank-p-WS6、Shinella、Mesorhizobium、Defluviimonas、Rhodobacter、norank-p-Parcubacteria和norank-p-Gracilibacteria在投加信號(hào)分子C6-HSL和C8-HSL后，相對(duì)豐度都出現(xiàn)了不同程度的下降. 在投加C6-HSL的反應(yīng)器中，norank_ f_Sandaracinaceae、norank_f_Saprospiraceae、Thauera、unclassified_f_Comamonadaceae、norank_o_Alphaproteobacteria_Incertae_Sedis、Dokdonella、norank_ f_Gemmatimonadaceae和Candidatus_Competibacter的相對(duì)豐度都發(fā)生了不同程度的上升；在投加C8-HSL的反應(yīng)器中，norank_f_Blastocatellaceae_Subgroup_4、DS-100、unclassified_ f_Blastocatellaceae_Subgroup_4、norank_ f_Anaerolineaceae和Leucobacter的相對(duì)豐度明顯增加. 這表明信號(hào)分子能夠顯著影響污水處理系統(tǒng)的微生物群落結(jié)構(gòu).

圖5 信號(hào)分子對(duì)生物脫氮功能微生物相對(duì)豐度的影響Fig.5 Effect of signal molecules on the relative content of function microorganisms involved in biological nitrogen removal

圖5顯示了系統(tǒng)中與脫氮相關(guān)的3種功能微生物〔氨氧化細(xì)菌(AOB)、亞硝化細(xì)菌(NOB)和反硝化細(xì)菌(DNB)〕相對(duì)豐度的變化情況. 由圖5可以看出，投加C6-HSL和C8-HSL后，3種功能微生物的相對(duì)豐度均有所上升，這也是系統(tǒng)硝化能力增強(qiáng)、TN去除率升高的原因. AOB的相對(duì)豐度在投加C6-HSL和C8-HSL后由0.3%分別增至0.5%和0.4%，其中，norank_f_Nitrosomonadaceae相對(duì)豐度的變化最為明顯，由0.2%分別增至0.4%和0.3%，Nitrosomonas的相對(duì)豐度由0.07%分別增至0.10%和0.09%，但Sphingomonas幾乎沒有發(fā)生變化. NOB的相對(duì)豐度在投加C6-HSL和C8-HSL后由0.03%分別增至0.07%和0.08%，其中，Nitrolancea由0.002%分別增至0.03%和0.06%，Nitrospira在投加C6-HSL的反應(yīng)器中由0.03%增至0.04%，在投加C8-HSL的反應(yīng)器中由0.03%減至0.02%. DNB的相對(duì)豐度在投加C6-HSL和C8-HSL后由6.3%分別升至8.5%和7.5%，其中Paracoccus、unclassified_f_Comamonadaceae、Defluviimonas、Hydrogenophaga的相對(duì)豐度依次由1.0%、1.1%、0.4%、0.2%分別升至2.2%、1.2%、0.9%、0.48%和2.3%、1.5%、0.6%、0.4%.

功能微生物相對(duì)豐度的變化是影響反應(yīng)器脫氮效果和N2O產(chǎn)生的根本原因. 投加信號(hào)分子后，AOB和NOB含量的上升使反應(yīng)器硝化效果提升(見表1)，但由于好氧反應(yīng)初期，系統(tǒng)中污染物濃度較高，AOB和NOB會(huì)對(duì)DO產(chǎn)生競爭，AOB的競爭力較強(qiáng)，從而導(dǎo)致一定時(shí)期內(nèi)硝化反應(yīng)停留在亞硝化階段，產(chǎn)生NO2--N積累現(xiàn)象[30-31]；同時(shí)，AOB也是硝化細(xì)菌反硝化反應(yīng)的作用微生物，在ρ(DO)較低時(shí)能夠通過反硝化作用把NO2--N還原為N2O，其含量的增加導(dǎo)致了好氧段N2O產(chǎn)生量的增加[2,32]. 因此，投加信號(hào)分子促進(jìn)AOB含量升高的同時(shí)，也增加了來自硝化細(xì)菌反硝化途徑的N2O產(chǎn)生量，這是投加信號(hào)分子導(dǎo)致N2O產(chǎn)生量增加的主要原因. 反硝化階段中，投加信號(hào)分子后，DNB的相對(duì)豐度上升，系統(tǒng)反硝化能力增強(qiáng)，TN去除率也隨之升高.

3 結(jié)論

a) 在AO工藝中，外源性信號(hào)分子C6-HSL和C8-HSL能夠顯著提高系統(tǒng)的脫氮效果，NH4+-N和TN去除率均有所上升.

b) 信號(hào)分子C6-HSL和C8-HSL對(duì)系統(tǒng)N2O產(chǎn)生量影響顯著，投加二者后N2O產(chǎn)生量分別增加了39.0%和11.0%，增量主要產(chǎn)生自AOB主導(dǎo)的硝化細(xì)菌反硝化反應(yīng).

c) 外源性信號(hào)分子能夠顯著影響污水處理系統(tǒng)的微生物群落結(jié)構(gòu)，兩種信號(hào)分子C6-HSL和C8-HSL均能夠增加系統(tǒng)AOB、NOB和DNB的相對(duì)豐度，這也是系統(tǒng)脫氮效率和N2O產(chǎn)生量變化的主要原因.