石油污染對場地中細菌群落的影響及其反饋機制

鄭一鳴， 何小松， 單光春,2， 崔 駿， 虞敏達， 趙航正,4， 席北斗*

1.中國環境科學研究院， 國家環境保護地下水污染模擬與防控重點實驗室， 北京 100012 2.哈爾濱工業大學環境學院， 黑龍江 哈爾濱 150090 3.中國環境科學研究院固體廢物污染控制技術研究所， 北京 100012 4.中國礦業大學(北京)化學與環境工程學院， 北京 100083

石油污染改變了土壤和地下水中微生物群落的組成與結構[1-2]. 在污染場地中，石油分布不均[3]，不同污染特征中的細菌群落分布與組成差異性較大[4]. 隨著分子生物學和高通量測序技術的發展，微生物組學的研究越來越深入[5]. Baas-Becking[6]認為“萬物無處不在，但環境選擇一切”. 不同生存環境下，確定性過程與隨機性過程發揮著不同的作用[7-8]. 傳統上，人們認為環境選擇等確定性過程決定了群落組裝過程[9]. 例如，生態位理論認為，生物和非生物因素對環境中細菌群落的相對豐度有重要影響，甚至影響某一物種的生存與否[10]. 其中，pH是確定性過程中對細菌群落結構影響的主要驅動力[11-12]. 地理距離、土壤有機質以及無機鹽離子也會對細菌群落分布產生重要影響[3,12]. 環境壓力和物種性狀在確定性過程中起著至關重要的作用[13]. 當外界干擾較小時，環境中細菌群落的演替方向變化也較小，當外界持續不斷干擾時，外源微生物入侵，可能會導致土著細菌群落結構變化，改變其演替方向[14]. 確定性過程會在不同尺度上影響群落的組裝[15]. 然而現有研究也發現，隨機性過程在某些群落組裝的過程中起主導作用[16-17]. 例如，中性理論認為，微生物的繁殖、遷移、死亡過程影響了隨機性過程[18]，并不是環境選擇而是微生物演替的隨機性影響了細菌物種相對豐度的變化[19]. 中性理論假設物種在生態位上都是等效的，隨機的出生、死亡、漂移以及物種的生成與滅絕等隨機性因素影響了微生物的群落結構. 已有研究證明，確定性過程和隨機性過程皆會對群落組裝產生重大影響[20]，但是在不同污染特征中其重要性存在差異[21-22]. 在高多樣性的環境中，隨機性過程占主導地位；而在多樣性低的環境中，確定性過程占主導地位[23]. 理解微群落組裝過程的基本生態機制是群落生態學尤其是微生物群落生態學的一大挑戰. 判斷確定性過程與隨機性過程在污染場地細菌群落組裝中發揮的作用對于理解污染生態學具有非常重要的意義. 目前對于石油污染場地中細菌群落特征的研究較少，且主要集中在石油污染對細菌群落多樣性的影響方面，然而在不同石油污染特征下細菌群落結構的變化與群落組裝機制仍不明確.

該研究選擇7個受石油污染程度不同的土壤樣品和2個受石油污染含水層沉積物樣品，采用熒光定量PCR(qPCR)和DNA高通量測序技術，分析了好氧與厭氧特征降解基因拷貝數和細菌群落多樣性差異，評估了不同石油污染生境對細菌群落多樣性的影響，分析了細菌對石油污染的反饋過程，揭示不同石油污染環境下細菌群落多樣性與污染特征的關系，進而明確不同污染生境細菌群落組裝的機制.

1 材料與方法

1.1 試驗場地與樣品采集

如圖1所示，樣品采集于甘肅省某石化場地，它是我國西北地區石化場地的典型代表，場地中存在油泥堆積區域，部分區域土壤污染嚴重.

圖1 采樣點分布Fig.1 Distribution of the sampling sites

于2019年12月選擇3個不同污染程度的區域表層(0～3 cm)采集石油污染固態樣品，分別為油泥堆積區域(A)、石油污染土壤區域(B)和未污染土壤區域(C)，以上3種環境均可認為是好氧環境；同時，對發生石油泄漏污染地下水的區域進行鉆井，獲得含水層沉積物樣品(D)，可認為是厭氧環境. 樣品信息見表1. 在油泥區域采集2個樣品，分別標記為S1和S2；石油污染土壤區域采集2個樣品，分別標記為S3和S4；在未污染土壤區域采集3個樣品，分別標記為S5、S6和S7；含水層沉積物樣品選擇2個井的沉積物；分別標記為S8和S9.

土壤樣品采集方法：在1 m2區域內，隨機選擇3～5個采樣點，用無菌鏟迅速采集表層(0～3 cm)土壤500 g放入塑封袋中密封低溫保存. 含水層沉積物樣品采集方法：在場地開鑿鉆孔，將含水層沉積物樣品去除泥皮，采集飽和含水層巖芯500 g，并用錫紙包裹放入密封袋中低溫保存，盡量排出袋內空氣. 所有樣品一式兩份，一份用于測試石油濃度，另一份用于測試細菌群落多樣性. 石油濃度的測試根據LU等[23]所述的方法進行.

表1 受石油污染的土壤與沉積物樣品的污染特征Table 1 Contamination characteristics of samples of petroleum-contaminated soils and sediments

1.2 熒光定量PCR

研究表明，alkB基因編碼的烷烴單加氧酶和nah基因編碼的萘雙加氧酶是研究細菌群落在生物修復位點好氧降解石油潛力的理想標記[24-26]. 烷基琥珀酸合成酶(ASS)的編碼基因ass被認為是厭氧體系中烷烴降解的唯一標志[27]. 也有研究表明，在厭氧環境中，大多數芳烴化合物都經過微生物作用，形成中間體6-十六氧環烯基-CoA. 該物質開環反應的關鍵酶是bamA基因編碼的6-十六氧環-1-烯-1-羰基CoA水解酶[28]. 采用熒光定量PCR技術，測試了alkB、nah、ass、bamA與石油降解有關的特征基因拷貝數. 每個樣品的4個基因均測試了6次，表2為各特征基因的引物名稱及序列.

1.3 細菌群落多樣性分析

用E.Z.N.A.?DNA Kit進行土壤微生物DNA樣品提取，用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)兩個引物對細菌16S rRNA基因的V4～V5區進行了PCR擴增.

表2 擴增特征基因所用的引物名稱與引物序列Table 2 The primer name and primer sequences used to amplify characteristic genes

用含4 μL的5×fastpfu緩沖液、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、0.8 μL 5 μmol/L引物、0.4 μL fastpfu聚合酶和10 ng模板DNA的混合物20 μL進行PCR反應. 用試劑盒提取擴增子在Illumina MiSeq平臺測序. 原始fastq文件用QIIME進行質量過濾.

PCR反應參數：95 ℃持續3 min；95 ℃持續30 s，27 ℃持續30 s，72 ℃持續45 s，循環55次；72 ℃持續45 s，10 ℃直至停止.

2 結果與討論

2.1 場地污染特征

油泥中的石油濃度較高，S1的石油濃度為 100 834 mg/kg，S2的石油濃度為 202 097 mg/kg. 油泥采樣地點為儲罐區，大量的石油產品長期泄露，導致該區域污染較為嚴重，成為油泥狀；石油污染土壤次之，S3的石油濃度為 1 255.12 mg/kg，S4的石油濃度為321.7 mg/kg；在場地中的部分區域雖然不是污染源區，但是由于石油具有一定的揮發性和遷移性，導致部分遷移性較強的石油入侵未污染區域，造成污染范圍擴大[29-30]；未污染土壤中也有極少量的石油，S5的石油濃度為0.13 mg/kg，S6的石油濃度為0.46 mg/kg，S7的石油濃度為0.34 mg/kg；含水層沉積物樣品的石油濃度差異性較大，S8的石油濃度為58 mg/kg，S2的石油濃度為 2 028 mg/kg. 由于地下環境異質性較強，水文地質條件較復雜[31]，地下環境的異質性導致了不同含水層沉積物污染特征的差異性[32].

注： A—油泥；B—石油污染土壤；C—未污染土壤；D—石油污染沉積物. 下同.圖2 不同污染特征的環境中4種降解基因的拷貝數Fig.2 Copies of four degradation genes in environments with different pollution characteristics

2.2 微生物降解基因與污染特征的關系

油泥、石油污染土壤和未污染土壤皆為好氧環境，而沉積物處于厭氧環境中. 圖2為不同污染特征下4種具有降解石油功能的基因拷貝數. 由圖2可見，油泥中alkB基因拷貝數(平均值為6.21×107copies/g)較高，石油污染土壤和未污染土壤中相對較少(平均值分別為1.38×107和1.88×107copies/g)，在受污染沉積物中最低(平均值為1.58×106copies/g)，較上述3種好氧環境下低了1個數量級. 油泥中，nah基因拷貝數較高(平均值為9.3×106copies/g)，可能是由于油泥中的高濃度石油促進了其增殖，nah基因拷貝數在石油污染土壤和未污染土壤中較少(平均值分別為9.94×105和3.37×105copies/g)，含水層受污染沉積物中nah基因拷貝數也較少(平均值為5.2×105copies/g).ass和bamA基因拷貝數在不同污染特征的環境中均較低，其中，ass基因拷貝數在油泥、石油污染土壤、未污染土壤和含水層沉積物中的平均值依次為1.99×105、2.11×105、8.86×105和9.43×103copies/g，bamA基因拷貝數則分別為3.51×107、5.08×107、8.84×107和4.86×106copies/g. 可見，在油泥、石油污染土壤和未污染土壤的好氧環境下，厭氧基因的增殖受到了限制. 在沉積物的厭氧環境下，厭氧基因拷貝數也較低，可能是由于在厭氧條件下很多微生物僅表現出石油的抗性，厭氧基因并不能有效增殖.

2.3 石油污染對場地中細菌群落多樣性的影響

表3為7組土壤樣品與2組含水層沉積物樣品的微生物高通量測序結果，所有樣品的物種覆蓋度均超過98%，說明測序深度足夠可以覆蓋絕大部分物種.α-多樣性可以反映環境中細菌群落的豐富度(Shannon-Wiener指數)、均勻度(Simpson指數)與多樣性(Ace指數與Chao1指數)[33-34]. 該研究中，隨著石油濃度的降低，土壤中細菌群落的Shannon-Wiener指數、Simpson指數、Ace指數與Chao1指數均呈增加趨勢. 不同污染特征的環境間細菌群落結構具有明顯的差異性，不同污染特征的環境中細菌群落多樣性與石油濃度呈顯著負相關(P<0.05). 圖3為不同污染程度下土壤和沉積物細菌群落之間的α-多樣性組間差異，結果顯示，未污染土壤與油泥之間細菌群落的α-多樣性組間差異性極為顯著(P<0.01)，未污染土壤與受污染沉積物之間的組間差異性也較為顯著(P<0.05). 與未污染土壤相比，油泥和受污染沉積物中細菌群落的α-多樣性降低了50%左右，而石油污染土壤中細菌群落的α-多樣性降低了33%左右. 石油污染土壤與受污染沉積物中的石油濃度相近，二者的α-多樣性也相近，氧氣含量對α-多樣性影響不大. 可見，高濃度石油污染是引起土壤和沉積物中微生物的群落組成變化的主要驅動因子，能夠顯著降低微生物群落的α-多樣性，而氧氣濃度并不是造成土壤與沉積物中微生物群落變化的主要驅動因子.

表3 9組土壤與沉積物樣品的微生物高通量測序結果Table 3 Result of bacteria high-throughput sequencing in 9 samples of soil and sediments

圖4 不同污染特征和不同濃度樣品的細菌群落Venn圖Fig.4 Venn diagram of bacteria community in different contaminated characteristic and different samples

注：*表示P<0.05，**表示P<0.01.圖3 不同污染特征的環境中α-多樣性組間差異Fig.3 The difference of α-diversity in environments with different pollution characteristics

圖5 9組樣品屬水平上細菌的相對豐度Fig.5 Relative abundance on genus level in 9 groups of samples

Venn圖可以區分共享的和唯一的OTUs(Operational Taxonomic Units)[35-36]. 由圖4可以看出，不同分組中油泥樣品中的特異性物種最少，僅有45個OTUs；石油污染土壤次之，有292個OTUs；未污染土壤樣品中的特異性物種最多，有 1 131 個OTUs；受污染沉積物中的特異性物種數量介于油泥和石油污染土壤之間，有124個OUTs. 油泥中石油含量最高，對土壤中微生物的毒害作用較大，導致其特異性物種數量降低[37]；石油污染土壤中含有幾百至幾千mg/kg濃度不等的石油，部分具有一定耐受性的物種可以在此環境中生存，其中微生物種群數量相對較高；未污染土壤中含有極少量的石油烴，遠未達到對微生物的致死作用，部分具有降解能力的微生物還可以將土壤中的微生物解毒，使其轉化為無毒無害的可利用有機物[38]，導致其中的微生物種群數量最多；對于沉積物中的微生物來說，由于其生活環境為厭氧，相對于好氧環境，微生物數量總體較少，所以其特異性物種主要為具有厭氧環境下利用石油烴作為碳源或能源的微生物. 由圖4可以看出，在9組不同樣品中都能夠存活的細菌OTU數量為20，說明這20種微生物在不同濃度、不同氧氣含量的環境下都能夠生存，具有較強的環境適應性，但是這20種微生物是否具有石油降解能力仍然不明晰.

圖5為屬水平物種相對豐度，不同污染特征樣品間有一定的差異性[39]. 其中，石油濃度較高的土壤和沉積物中Pseudomonas相對豐度均較高，石油濃度較高的土壤中Acidovoras相對豐度較低，石油濃度較低的土壤和未污染土壤中Pseudarthrobacter相對豐度均較高，Pseudoxanthomonas只在油泥中有檢出，可能是較高的石油濃度選擇出具有石油降解能力(或具有石油抗性)的微生物[40].Methylotenera只在含水層沉積物中被檢測到，推測其與厭氧降解石油(厭氧石油抗性)有關，Spingomonas在油泥中未被檢出，而在未污染土壤和受污染沉積物中存在，但是在受污染沉積物中其相對豐度較低，可以推斷，這種微生物對石油的抗性較差，且在厭氧條件下活性較高.

注： 虛線表示確定性與隨機性的分界限.圖6 不同污染特征的環境中 細菌群落βNTI值Fig.6 βNTI diagram of bacteria community in environments with different pollution characteristics

2.4 細菌群落組裝

為了量化確定性過程和隨機性過程在石油污染場地細菌群落演替中的作用，該研究使用了加權豐度β-平均最近分類數值(βNTI)量化了群落組裝之間的系統發育距離(見圖6). βNTI<-2或βNTI>2表明確定性過程占主導地位；-2<βNTI<2表明隨機性過程占主導地位；βNTI為2或-2，則不能判斷群落組裝過程[20]. 不同污染特征的環境在受到石油入侵后，細菌群落組裝過程受到不同程度的影響. 油泥、石油污染土壤及未污染土壤等好氧環境下|βNTI|<2，表明細菌群落組裝是隨機性過程，受污染沉積物的厭氧環境下βNTI>2，細菌群落組裝為確定性過程. 這表明石油在入侵土壤后，多樣化過程和漂變過程占主導作用，而環境選擇對細菌群落的影響較小[41]，導致細菌能夠通過變異或者水平基因轉移等方式獲得新的表型并形成新的區系. 但是在受污染沉積物中，細菌群落組裝主要受環境選擇的影響[18]. 這說明含水層沉積物中可能存在部分物種有著獨特的、與厭氧石油污染環境相適應的表型，使它們可以在厭氧石油污染下生存，而土壤環境中這類物種很少，可能是由于土壤環境不穩定，微生物演替未完成，細菌群落結構不僅受石油濃度的影響，而且還會受到其他環境因素的影響[42]. 好氧環境中，微生物的生態位在環境影響下會發生變化，石油對微生物的選擇作用不是絕對的環境優勢，在油泥、石油污染土壤中發現了大量不能降解石油的微生物類群存在，在未污染土壤中同樣也發現了一些具有石油降解能力的微生物. 在厭氧環境中，環境相對封閉，與外界環境交流較少，石油濃度是有較大選擇作用的環境因子，且含水層沉積物中細菌種類相對較少，群落穩定性較差，受到石油污染后，細菌群落迅速發生變化，其他環境因子的選擇作用相對較小. 但是在沉積物中厭氧降解石油的基因含量較低，可以推測，在石油污染含水層沉積物后，大量微生物類群滅亡，造成了細菌群落的改變，而部分未死亡的微生物也不具有石油降解能力.

3 結論

a) 石油污染改變了慶陽石化老廠區中土壤和沉積物中細菌群落的豐富度、多樣性及均勻度，細菌群落的α-多樣性與石油濃度呈顯著負相關(P<0.05). 高濃度的石油能夠在好氧條件下促進alkB基因和nah基因的增殖.

b) 該場地土壤和沉積物中的細菌種群數量與石油濃度呈顯著負相關(P<0.05)，污染場地不同污染特征的環境中細菌群落在門水平上具由較高的相似度，需要在屬水平上加以區分. 污染源區與非污染源區土壤和沉積物之間的細菌群落結構差異性較大，不同濃度石油的毒性作用差異性較大，不同微生物對石油的耐受程度不同，環境的差異性也會導致細菌群落的差異性.

c) 在該石油污染場地的土壤中，土壤細菌群落組裝中隨機性過程占主導地位，含水層沉積物的細菌群落組裝中確定性過程占主導地位. 土壤環境中具有好氧石油降解基因，而在沉積物中厭氧降解石油的基因含量較低，大部分微生物在石油污染發生后死亡，部分生存的微生物不具有石油降解能力，僅有抗性的表型，或者是處于休眠狀態.