血清miR-146a水平與小兒支氣管哮喘發作期中醫證型的相關性分析*

李香玉，周 旋，陳莉麗

(長春中醫藥大學附屬醫院， 長春 130000)

支氣管哮喘簡稱哮喘，是兒科常見呼吸系統慢性炎癥性疾病，臨床主要表現為喘息、胸悶、呼吸困難等癥狀[1-2]。有研究報道，全世界哮喘發病人數不斷升高，尤以嬰幼兒的發病率常年居高不下，其長期反復發作的特點給家庭帶來諸多方面負擔[3]。中醫認為，哮喘急性發作病因為肺中伏痰、氣道受阻、咳嗽多痰故而生喘，其中以風寒、風熱為主引發哮喘反復發作，久病不愈常導致腎陽虛弱，因此有中醫學家將小兒哮喘發作期哮喘按寒熱虛實辨證。如馬融教授[4]根據中醫辨證分型將發作期哮喘分為寒哮型、熱哮型、外寒內熱型、虛實夾雜型。中醫多從宏觀角度對哮喘進行辨證論證，現代醫學多從實驗檢測方面入手，二者相結合對臨床更有指導意義。

目前大量研究發現，微小RNA(microRNA，miRNA)在哮喘發病機制中發揮著重要作用。已有研究發現，微小RNA-146a(miR-146a)與類風濕關節炎中醫證型有關[5]，miR-146a基因多態性與兒童哮喘易感性密切相關[6]。但未見關于血清miR-146a表達與小兒哮喘中醫證型關系的研究報道。因此，本研究旨在分析血清miR-146a水平與小兒哮喘中醫證型的關系，為其治療及機制研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年3月至2019年3月長春中醫藥大學附屬醫院兒科收治的130例哮喘發作期患兒進行研究(即哮喘組)，選取同期130例體檢健康兒童作為對照組。最終納入哮喘組男76例，女54例；年齡3～12歲，平均年齡(7.56±2.18)歲；對照組男79例，女51例；年齡3～14歲，平均年齡(8.02±2.35)歲。2組受試兒童性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經長春中醫藥大學附屬醫院倫理委員會批準(批準文號20161218)。

1.2 診斷標準

哮喘組診斷依據兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)中的診斷標準制定[7]。

1.3 辨證分型標準

中醫辨證分型參考《中醫兒科學》制定辨證標準，將哮喘組患兒分為熱哮型、外寒內熱型、寒哮型、虛實夾雜型4種類型[4]。

1.4 納入標準

符合哮喘發作期中西醫診斷標準[7]；符合中醫辨證分型標準[4]；年齡<14歲；監護人知情并簽署知情同意書。

1.5 排除標準

哮喘緩解期者；由縱膈腫瘤、心源性疾病繼發的哮喘者；伴肺心病、呼吸衰竭者；伴心血管、肝、腎等嚴重疾病者；伴造血系統障礙疾病者；合并呼吸道傳染病者；依從性差者；精神失?；純?。

1.6 樣本收集

所有受試兒童抽取清晨空腹肘靜脈血3 mL，室溫靜止25 min，2800 r/min離心20 min，分離上清，超低溫凍存待檢。

1.7 主要試劑與儀器

miR-146a、U6引物由美國Invitrogen公司設計并合成。mir VanaTMPARISTMKit試劑盒(Ambion，貨號AM1556)；Taq Man?Micro RNA Reverse(美國Life Technologies公司，貨號80284)；Transcription Kit(上海熹垣生物科技有限公司，貨號XY-JBS-PCR-519XS)；Taqman?Universal Master Mix II(上海恒斐生物科技有限公司，貨號444-0040)；Taq Man?Micro RNAAssay試劑盒(ABI，貨號403061)；總IgE試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司，貨號JK-(a)-1665)；人白介素6 ELISA試劑盒(杭州聯科生物技術股份有限公司，貨號70-EK106/2-96)；人嗜酸性粒細胞檢測試劑盒(上海滬震實業有限公司，貨號hz-H2341c)；分光光度計(Eppen dorf，型號Biophotometer)；普通PCR儀(Bio-Rad，型號T100)；G-3000熒光定量PCR儀(Corbett Research，型號Rotor-Gene 3000 A)。

1.8 觀察指標與方法

1.8.1 血清miR-146a檢測 采用實時熒光定量PCR法檢測血清miR-146a表達。miR-146a引物序列：上游引物：5’-CGGATCCTTGGTCTCCTCCAGATGTTTAT-3’，下游引物：5’-CCTCGAGT}CATTAAAGTGATTTCTCCCAAG-3’，內參U6：上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3’，下游引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；總RNA提取、純化，逆轉錄合成cDNA，反應條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5min，以U6為內參進行PCR擴增，反應條件：50 ℃ 2min 1個循環，95 ℃ 10 min 1個循環，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s 40個循環，具體實驗步驟參照試劑盒說明書操作，采用2-ΔΔCT方法計算血清miR-146a相對表達量。

1.8.2 病情控制評估 采用哮喘控制測試(asthma control test，ACT)評分[8]評估病情，患兒與家屬共同填寫ACT表，共包括7個問題，前4個問題為0～3分，由患兒獨立完成，后3個問題0～5分，由家屬完成，總分25分，分數越高說明患兒病情控制越好。

1.8.3 血清指標檢測 采用酶聯免疫法使用相應的試劑盒檢測受試者血清白細胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、總免疫球蛋白E(Immunoglobulin E，IgE)、嗜酸性粒細胞水平。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 130例哮喘患兒中醫證型分布情況

收治的130例哮喘發作期患兒中，熱哮型58例(44.62%)，外寒內熱型40例(30.77%)，寒哮型患兒32例(24.61%)，虛實夾雜型0例，以熱哮型、外寒內熱型、寒哮型常見。

2.2 2組受試兒血清miR-146a表達及相關炎癥因子水平比較

表1示，哮喘組患兒血清miR-146a表達、IL-6、總IgE、嗜酸性粒細胞水平明顯高于對照組(P<0.05)。

表1 2組受試兒血清miR-146a及炎癥因子表達比較

2.3 不同中醫證型哮喘患兒血清miR-146a水平比較

表2示，寒哮型、外寒內熱型患兒血清miR-146a表達均顯著高于熱哮型(P<0.05)，寒哮型血清miR-146a表達高于外寒內熱型(P<0.05)。

表2 不同中醫證型哮喘患兒血清miR-146a表達比較

2.4 不同中醫證型哮喘患兒血清相關炎癥因子水平比較

表3示，寒哮型、外寒內熱型患兒血清IL-6、總IgE、嗜酸性粒細胞水平均顯著高于熱哮型(P<0.05)，寒哮型血清IL-6、總IgE、嗜酸性粒細胞水平高于外寒內熱型(P<0.05)。

表3 不同中醫證型哮喘患兒血清相關炎癥因子水平比較

2.5 不同中醫證型哮喘患兒ACT評分比較

表4示，寒哮型、外寒內熱型患兒ACT評分明顯低于熱哮型(P<0.05)，寒哮型低于外寒內熱型(P<0.05)。

表4 不同中醫證型哮喘患兒ACT評分比較(分，

2.6 不同中醫證型患兒血清miR-146a表達與ACT評分關系

圖1～3示，寒哮型患兒血清miR-146a表達量與ACT評分呈正相關(r=0.700，P=0.000)；外寒內熱型患兒血清miR-146a表達量與ACT評分呈正相關(r=0.591，P=0.000)；熱哮型患兒血清miR-146a表達量與ACT評分呈正相關(r=0.488，P=0.005)。

圖1 寒哮型患兒血清miR-146a表達與ACT評分相關性

圖2 外寒內熱型患兒血清miR-146a表達與ACT評分相關性

圖3 熱哮型患兒血清miR-146a表達與ACT評分相關性

3 討論

哮喘屬于中醫學“喘鳴”“喘息”“呷嗽”“喘咳”范疇?！端貑枴り庩杽e論篇》有云：“陰爭于內……起則熏肺，使人喘鳴。”《諸病源候論·上氣喉中如水雞鳴候》曰：“肺病令人上氣……喘息不調，致咽喉……如水雞之鳴也。”元·王執中《針灸資生經·喘》中首現“哮喘”之名。近代醫家對小兒哮喘發作期辨證分型存在諸多不同觀點。廖芳菊等[9]主張按“寒性哮喘、熱性哮喘、外寒里熱”3個證型對急性發作期哮喘患兒進行辨證治療，療效較好。本研究結果顯示，收治的130例哮喘發作期患兒中，熱哮型58例(44.62%)，外寒內熱型40例(30.77%)，寒哮型32例(24.61%)，與上述研究結果相似，提示小兒哮喘發作期以熱哮、外寒內熱、寒哮多見。哮喘發作期患兒存在免疫調節失衡現象。目前認為，Th1/Th2失衡是哮喘發病的重要機制，平衡向Th2遷移，Th2型細胞因子增多進而會加重氣道炎癥，導致哮喘急性發作[10]。當外界過敏原進入機體后，過敏原與IgE抗體結合，引起肥大細胞活化，分泌活性介質，導致氣道炎癥。穆清爽等[11]發現，哮喘患者中血清IL-6、嗜酸性粒細胞、總IgE水平高于健康者。本研究發現，哮喘患兒血清IL-6、嗜酸性粒細胞、總IgE水平高于健康兒童，且寒哮型、外寒內熱型、熱哮型患兒血清IL-6、總IgE、嗜酸性粒細胞水平依次降低，提示哮喘患兒發病可能與氣道炎癥相關，且不同證型哮喘患兒氣道炎癥程度不同。

miRNA是非編碼小RNA，大量研究證實miRNA表達異常與哮喘的發生發展密切相關[12]。穆清爽等[13]研究發現，miRNA-126在哮喘急性加重期患者血漿中低表達，并能通過調節Th2優勢轉化提高IL-6、嗜酸性粒細胞及IgE水平，加重患者炎癥反應，促進病情發展。miR-146a在多種疾病中異常表達，有研究報道其表達與氣道炎癥性疾病相關。而miR-146a高表達可抑制Th1分化，促進Th2分化白細胞介素-4等促炎因子表達，參與炎癥反應[14-15]。Comer等[16]發現，miR-146a在哮喘患者氣道平滑肌細胞中表達水平上調，且miR-146a能間接調控IL-6、IL-8等炎性細胞因子，并不抑制IL-6、IL-8因子產生。Zhang等[17]研究發現，miR-146a在哮喘患兒血漿中表達升高，miR-146a過表達可下調其靶基因表皮生長因子受體進而抑制支氣管平滑肌細胞增殖，促進其凋亡。本研究結果顯示，哮喘組患兒血清miR-146a表達高于對照組，與上述研究結果相似，提示miR-146a可能與其致病機制相關。黃永蓮等[18]發現，哮喘虛證肺氣虛證型、肺脾兩虛證型、肺腎兩虛證型患者病情依次加重，肺功能隨著病情加重逐漸降低。吳志洪等[19]發現，miR-146a在不同證型特應性皮炎患者皮損標本中有顯著差異。本研究進一步發現，熱哮型、外寒內熱型、寒哮型患兒血清miR-146a表達依次升高，提示血清miR-146a表達與哮喘發作期不同中醫證型有關。通過血清miR-146a檢測，可能有助于小兒哮喘發作期中醫分型。寒哮型哮喘為外寒邪侵入、內寒痰伏肺俞、痰阻氣道、肺氣上逆而致，而兒童肺、脾、腎三臟功能不足可致脾胃虛寒，加重患兒病情，其病情加重可能促進血清miR-146a表達，具體機制還需進一步研究。對不同中醫證型患兒ACT評分研究發現，寒哮型、外寒內熱型患兒ACT評分低于熱哮型，寒哮型低于外寒內熱型，提示寒哮型、外寒內熱型哮喘發作期患兒病情控制較差。最后研究結果顯示，寒哮型、外寒內熱型、熱哮型患兒miR-146a表達與ACT評分均呈正相關，提示哮喘發作期不同中醫證型患兒血清miR-146a表達越高病情控制越差。

綜上所述，本研究發現哮喘發作期患兒血清miR-146a高表達，miR-146a在不同中醫證型哮喘患兒血清中表達量有明顯差異，臨床進行血清miR-146a檢測可能有利于小兒哮喘中醫分型。本研究對象較少，僅對哮喘發作期患兒進行研究，缺乏對哮喘持續期、緩解期患兒的研究結果，還需開展大樣本量、多證型研究，以提高研究的準確性。