葉酸促進髓鞘形成及損傷后再生的作用研究

肖秀清?陳亞霜?李靜?趙宜鵬?陳晨?邱偉?彭立勝

【摘要】目的 探討葉酸對髓鞘形成和炎性損傷后髓鞘再生的作用。方法 體外培養(yǎng)SD大鼠的小腦切片，在正常培養(yǎng)條件或溶血卵磷脂（LPC）誘導的脫髓鞘狀態(tài)下給予葉酸處理，觀察髓鞘堿性蛋白（MBP）的表達及與神經(jīng)微絲蛋白（NF）共定位情況。觀察葉酸干預對實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）大鼠模型脫髓鞘癥狀的影響。結(jié)果 正常培養(yǎng)條件下，葉酸處理組的小腦切片MBP表達水平升高，MBP-NF共定位程度增加; LPC引起的脫髓鞘狀態(tài)下，葉酸處理組MBP表達得到恢復，MBP-NF共定位程度增加（P均< 0.05）。葉酸干預治療EAE大鼠，其臨床癥狀評分顯著降低（P均< 0.05），脊髓脫髓鞘現(xiàn)象明顯改善。結(jié)論 葉酸可促進體外髓鞘形成及體外和體內(nèi)炎性脫髓鞘損傷后的髓鞘再生。

【關鍵詞】葉酸;髓鞘堿性蛋白;脫髓鞘;髓鞘再生;實驗性自身免疫性腦脊髓炎

Study of the effect of folic acid on promoting myelination and remyelination Xiao Xiuqing， Chen Yashuang， Li Jing， Zhao Yipeng， Chen Chen，Qiu Wei， Peng Lisheng. Department of Neurology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Peng Lisheng， E-mail： penglsh@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】Objective To evaluate the effect of folic acid on myelination and remyelination after inflammatory injury. Methods Organotypic cerebellar slices of SD rats were cultured in vitro and exposed to folic acid or induced demyelination by lysophosphatidylcholine （LPC）. The expression level of myelin basic protein （MBP） and the colocalized points of MBP and neurofilament （NF） in organotypic cerebellar slices were detected. The effect of folic acid on the demyelination symptoms in the rat models with experimental autoimmune encephalomyelitis （EAE） was evaluated. Results The expression level of MBP and the co-localizition of MBP-NF were significantly increased under normal culture condition;Under the status of LPC-induced demyelination， the expression level of MBP was significantly restored and the co-localizition of MBP-NF was remarkably enhanced （all P < 0.05）. In the EAE rats treated with folic acid， the clinical symptom scores were significantly decreased （all P < 0.05） and the spinal cord demyelination were considerably mitigated. Conclusion Folic acid can promote the myelination in vitro and accelerate the remyelination in vitro and in vivo after injury.

【Key words】Folic acid;Myelin basic protein;Demyelination;Remyelination;

Experimental autoimmune encephalomyelitis

髓鞘是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中包裹神經(jīng)元軸突的多層髓磷脂膜，對于維持軸突的信號傳導十分重要[1]。在多發(fā)性硬化（MS）等脫髓鞘疾病中，形成髓鞘的少突膠質(zhì)細胞大量死亡，大腦和脊髓出現(xiàn)脫髓鞘病灶，導致軸突變性和萎縮，從而引發(fā)機體行動功能障礙，病情嚴重時可出現(xiàn)癱瘓[2]。目前臨床對于這類炎性脫髓鞘疾病的治療策略主要是通過改善免疫系統(tǒng)，減輕CNS的炎癥損傷，從而減少疾病的復發(fā)，延緩疾病的進展。但這種免疫調(diào)節(jié)治療方案對已受損的髓鞘無明顯改善[3]。溶血卵磷脂（LPC）誘導的大鼠小腦切片脫髓鞘模型，可模擬脫髓鞘疾病中軸突髓鞘形成、脫髓鞘和髓鞘再生的復雜過程。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）大鼠模型是一種神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性動物模型，由多種免疫病理學和神經(jīng)病理學機制之間的相互作用引發(fā)大鼠機體炎癥脫髓鞘、軸突丟失和神經(jīng)膠質(zhì)增生等癥狀，與MS病理特征相似。LPC脫髓鞘模型和EAE動物模型是研究CNS炎性脫髓鞘和髓鞘再生的體內(nèi)外經(jīng)典模型，被廣泛用于研究MS疾病的病理進程和新藥的療效評估[4]。

葉酸作為一種B族維生素，對CNS的發(fā)育和修復均有一定促進功能，葉酸可增強DNA的甲基化從而維持磷脂膜的穩(wěn)定，葉酸缺乏會影響髓磷脂的完整性導致髓鞘的降解。有研究表明，與健康對照組相比，MS患者的同型半胱氨酸水平升高，葉酸水平降低[5-6]。高同型半胱氨酸水平導致低甲基化水平，影響髓鞘的修復，最終導致髓鞘結(jié)構破壞，而葉酸可降低同型半胱氨酸水平從而改善脫髓鞘癥狀[7-8]。但是目前尚未有葉酸參與髓鞘形成和髓鞘再生的直接證據(jù)。

本研究組通過觀察葉酸在體外和體內(nèi)模型中對髓鞘形成以及對脫髓鞘損傷后再生的影響作用，探索葉酸改善神經(jīng)系統(tǒng)功能的機制以及將其用于臨床治療脫髓鞘疾病的理論依據(jù)。

材料與方法

一、實驗方法

本動物實驗倫理經(jīng)中山大學實驗動物管理與使用委員會審批通過（SYSU-IACUC-F3-20-0801），所有操作均符合實驗動物倫理要求。

1.大鼠小腦切片

1.1 小腦切片培養(yǎng)

參照文獻[9]的方法，選用出生第7日的SD大鼠36只（購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心），在無菌環(huán)境中將其小腦取出，在預冷的HBSS緩沖液（Gibico）中剝?nèi)ツX膜后置于切片機上，沿矢狀面進行小腦切片（厚度350 μm），取中間部位的小腦切片并轉(zhuǎn)移至0.4 μm孔徑的PET膜培養(yǎng)板（Corning）中培養(yǎng)。在下層培養(yǎng)室中加入腦片組織培養(yǎng)液：48% MEM、25%熱滅活的馬血清、25% EBSS、6.5 mg/ml D-葡萄糖、1%青鏈霉素、1%谷氨酰胺（Gibico）。將上述處理好的小腦切片組織放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔2 d半量換液。在后續(xù)步驟中將小腦切片組織按不同處理方法分為對照組、不同濃度葉酸處理組、LPC脫髓鞘損傷組（包括葉酸處理組與無葉酸處理組）。

1.2 小腦切片給藥和損傷后給藥處理

為檢測葉酸在正常培養(yǎng)條件下能否促進髓鞘的形成。先體外培養(yǎng)小腦切片3 d，使其修復切片過程中造成的機械損傷，然后加入不同濃度葉酸（20、100、500 nmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)4 d，每隔2 d半量換液，培養(yǎng)至第7日時收集組織樣本進行后續(xù)的實驗分析。

為檢測葉酸能否促進LPC脫髓鞘損傷后的髓鞘再生。在小腦切片組織培養(yǎng)至第6日時，于培養(yǎng)基中加入0.5 g/ml 的LPC（Sigma）作用18 h，造成髓鞘結(jié)構的破壞。用新鮮培養(yǎng)基清洗小腦切片2次，換用含100 nmol/L葉酸的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 d，每隔2 d半量換液，培養(yǎng)至第10日時收集組織樣本進行后續(xù)的實驗分析。

1.3 蛋白免疫印跡法

將小腦切片用磷酸鹽緩沖液（PBS）潤洗2次，向12孔板內(nèi)小室中的每孔加入等量RIPA裂解液置于冰上裂解5 min，用移液槍反復吹打使組織充分裂解，收集裂解液后以10 000×g離心收集上清加入SDS loading buffer，95℃水浴5 min使蛋白變性。采用SDS-PAGE凝膠電泳，用15%的分離膠分離髓鞘堿性蛋白（MBP）。用半干轉(zhuǎn)膜法將MBP轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用3%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入MBP抗體（Proteintech）后在4℃水平搖床孵育過夜，用TBST洗去一抗，加入相應的二抗（Proteintech）室溫孵育1 h后，再用TBST洗去二抗，使用化學發(fā)光成像儀成像。用Quantity One軟件分析條帶的灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，對MBP的相對表達量進行統(tǒng)計分析。

1.4 免疫熒光法

用PBS潤洗小腦切片2次，用4%多聚甲醛固定45 min后，加入含0.5% Triton-X100的10%山羊血清中封閉并通透2 h，加入一抗MBP抗體、神經(jīng)微絲蛋白（NF）抗體（Aves Labs）于4℃ 孵育48 h，待其恢復至室溫后，用PBS洗去一抗，然后加入相應的熒光二抗（Goat anti-Rabbit488，Goat anti-Chicken546，Invitrogen）避光孵育1 h，用PBS洗去二抗后封片，用共聚焦顯微鏡觀察各組MBP和NF共定位表達情況并拍照記錄。用Image J-win32軟件分析各組MBP和NF共定位區(qū)域與NF的比值，并對各組的髓鞘形成指數(shù)進行統(tǒng)計分析。

2. EAE模型

2.1 EAE模型的建立及葉酸處理

將18只6 ～ 8周雌性Lewis大鼠（150 ～ 180 g）隨機分為對照組、EAE模型組、EAE葉酸處理組各6只。對EAE模型組和EAE葉酸處理組大鼠的尾根皮下注射豚鼠脊髓勻漿和弗氏完全佐劑制成的抗原乳劑0.4 ml，并在其后背部注射百日咳毒素0.1 ml（含菌量為1010 個/ml）誘導EAE模型。對照組在大鼠尾根皮下注射弗氏完全佐劑和生理鹽水制成的乳劑，并在其后背部注射相同劑量百日咳毒素。EAE葉酸處理組于造模當日開始每日腹腔注射葉酸80 μg/kg，對照組和EAE組注射等體積生理鹽水。

2.2 大鼠臨床癥狀評分

每日上、下午觀察2次大鼠，并對其進行臨床癥狀評分。臨床癥狀評分采用6分標準：0分，無明顯異常;1分，尾巴無力;2分，后肢無力;3分，后肢嚴重癱瘓;4分，四肢癱瘓;5分，瀕死或死亡[10]。

2.3勞克堅牢藍（LFB）髓鞘染色和HE染色

造模第17日時，EAE大鼠處于疾病峰期，取材觀察此時期各組大鼠脊髓的脫髓鞘情況。用水合氯醛麻醉大鼠，心臟灌注后取出其脊髓放入4%多聚甲醛中固定。將脊髓腰部位置的組織石蠟切片后脫蠟，置于固藍染液中孵育過夜，在95%乙醇中洗脫1 min，用0.05%碳酸鋰溶液洗10 s。HE染液處理1 min，0.1%結(jié)晶紫復染1 min，脫色后封片。置于光學顯微鏡下觀察記錄髓鞘脫失情況。

二、統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 25.0分析數(shù)據(jù)。實驗數(shù)據(jù)符合正態(tài)性和方差齊性，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步的兩兩比較采用LSD-t檢驗，重復測量資料采用重復測量資料方差分析。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

一、葉酸對髓鞘形成的影響

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，100、500 nmol/L葉酸處理組中髓鞘的標記蛋白MBP表達水平均升高（F = 21.933、21.620，P均 < 0.001），20 nmol/L葉酸處理組的MBP表達水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（F = 5.242，P = 0.387），見圖1。上述結(jié)果表明，100 nmol/L濃度的葉酸可促進MBP的表達，因此我們在后續(xù)實驗中選100 nmol/L濃度作為葉酸處理組。免疫熒光結(jié)果顯示，與對照組相比，葉酸處理組的MBP表達水平升高，且與軸突標記物NF共定位程度更高，比較差異有統(tǒng)計學意義（t = 3.464，P = 0.026），見圖2。上述結(jié)果表明葉酸能促進髓鞘形成。

二、葉酸對LPC脫髓鞘損傷的髓鞘再生的影響

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，LPC脫髓鞘損傷組的小腦切片中MBP表達水平降低（LSD-t = 7.681，P < 0.001）。經(jīng)過葉酸處理后，小腦切片中MBP的表達水平上升（LSD-t = 8.582，P < 0.001），且與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（LSD-t = 0.920，P = 0.555），即MBP表達水平恢復，見圖3。免疫熒光結(jié)果顯示，與對照組相比，LPC脫髓鞘損傷組的小腦切片的髓鞘結(jié)構遭到破壞，MBP和NF共定位區(qū)域減少（LSD-t = 7.434，P < 0.001），而經(jīng)葉酸處理后，小腦切片中MBP和NF共定位區(qū)域增多（LSD-t = 8.878，P < 0.001），并且多于對照組（LSD-t = 2.536，P = 0.011），見圖4。以上結(jié)果表明葉酸能改善LPC引起的脫髓鞘損傷，促進髓鞘再生。

三、葉酸對EAE大鼠臨床癥狀評分的影響

EAE大鼠臨床癥狀評分顯示，對照組未出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)行為學癥狀，癥狀評分全部為0。EAE模型組大鼠于造模后第8日發(fā)病，主要表現(xiàn)為精神萎靡、尾部及四肢癱瘓無力、活動減少。EAE葉酸處理組大鼠于造模后第10日發(fā)病，癥狀同EAE模型組相似。有2只EAE組的大鼠由于發(fā)病過重于造模后第15、16日相繼死亡，EAE葉酸處理組大鼠未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。重復測量資料的方差分析顯示葉酸給藥與時間之間的交互效應有統(tǒng)計學意義（F = 48.882，P < 0.001），時間效應（F = 67.691，P < 0.001）和葉酸給藥效應也有統(tǒng)計學意義（F = 51.533，P < 0.001）。從造模后第10日至實驗結(jié)束，EAE葉酸處理組的大鼠臨床癥狀評分均較EAE模型組低（t10 d = 5.335，P = 0.016;t11 d?= 5.889，P < 0.001;t12 d = 4.993，P = 0.023;t13 d = 6.661，P<0.001;t14 d = 6.753，P < 0.001;t15 d = 9.520，P < 0.001;t16 d = 7.667，P < 0.001;t17 d = 9.847，P < 0.001），見圖5。

四、葉酸對EAE大鼠脊髓脫髓鞘的影響

EAE發(fā)展到第18日時，大鼠處于疾病的峰期，此時檢測各組大鼠脊髓脫髓鞘情況。LFB染色結(jié)果顯示，EAE模型組LFB著色較淺，髓鞘排列疏松、髓鞘結(jié)構部分崩解，部分區(qū)域無LFB著色，只有HE的底色，脫髓鞘情況嚴重。EAE葉酸處理組LFB染色加深，髓鞘損傷減輕，髓鞘結(jié)構致密無脫髓鞘區(qū)域。從病灶數(shù)和嚴重程度方面觀察，EAE葉酸處理組脫髓鞘現(xiàn)象均有所減輕，見圖6。

討論

脫髓鞘疾病是以CNS髓鞘脫失為始發(fā)或主要病變，但神經(jīng)元胞體、軸索和神經(jīng)膠質(zhì)細胞受損相對較輕的一類神經(jīng)系統(tǒng)疾病[11]。目前國內(nèi)學者對脫髓鞘疾病主要應用激素類和丙種球蛋白類藥物進行治療，這類藥物可暫時緩解臨床癥狀和減少疾病的復發(fā)，但不能促進髓鞘的修復和再生[3]。髓鞘再生是治療脫髓鞘疾病的重要策略，其過程與神經(jīng)功能的恢復及臨床癥狀的改善密切相關。有研究者發(fā)現(xiàn)47%的MS患者的脫髓鞘病變區(qū)域的髓鞘再生少于10%，而僅有20%的MS患者可有效修復60%的脫髓鞘病變區(qū)域，且髓鞘修復的水平與患者的殘疾癥狀恢復程度呈正相關。這表明通過促進受損的髓鞘再生來治療MS的研究方向有重要價值[12]。開發(fā)可改善MS等脫髓鞘疾病患者髓鞘再生的藥物成為了近十年的熱點[13]。

維生素B是一種被廣泛應用的髓鞘再生過程的強效調(diào)節(jié)劑，在MS患者中維生素B缺乏癥通常與慢性疲勞、炎性疾病和脫髓鞘有關[5]。維生素B在維持人體神經(jīng)生理功能中發(fā)揮重要作用，且能影響MS的病理生理過程[14]。葉酸作為B族維生素，是甲基化反應中重要的輔助因子，對DNA的合成和修復、脂肪酸和某些氨基酸的代謝以及神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能都至關重要，能防止因甲基化改變導致的脫髓鞘[13]。一項Meta分析顯示，MS患者體內(nèi)的葉酸和維生素B12水平比健康人低[15]。且有臨床研究顯示，MS患者補充葉酸（200 ～ 300 mg/d）

能改善患者的神經(jīng)系統(tǒng)狀態(tài)，患者的總體狀況有好轉(zhuǎn)，癥狀減輕，葉酸還能改善MS患者的疲勞乏力癥狀[16-17]。然而葉酸能否通過促進髓鞘形成和修復來改善MS患者的總體癥狀，我們發(fā)現(xiàn)目前尚未有研究報道。

我們通過體外和體內(nèi)模型研究葉酸對髓鞘形成和脫髓鞘損傷后再生的作用。在體外模型方面，通過培養(yǎng)大鼠的器官型小腦切片模型驗證葉酸是否對髓鞘形成和脫髓鞘損傷后的再生有促進作用。器官型小腦切片是研究髓鞘形成和髓鞘再生過程不受免疫系統(tǒng)干擾的體外模型[9]。本研究顯示，在器官型小腦切片模型中加入葉酸后，MBP表達水平升高，且與NF共定位增加，說明包裹在軸突上的髓鞘分布增多，髓鞘形成指數(shù)升高。當器官型小腦切片暴露在LPC損傷中時，MBP表達水平下降，且免疫熒光法顯示有MBP共定位的軸突數(shù)量減少，與其他研究者報道的LPC處理后會發(fā)生髓鞘脫失的現(xiàn)象一致[9]。用葉酸處理LPC脫髓鞘的器官型小腦切片培養(yǎng)物3 d后，MBP表達水平和髓鞘形成指數(shù)增高，且恢復程度與對照組無統(tǒng)計學差異。以上結(jié)果提示葉酸具有促進髓鞘的形成和使脫失的髓鞘得到有效再生的作用。

我們還通過EAE大鼠模型得到了葉酸具有促進體內(nèi)炎性髓鞘損傷修復的證據(jù)。EAE是模擬MS的一種慢性脫髓鞘疾病模型，EAE大鼠與MS患者臨床癥狀相似，伴有脊髓的明顯病變，出現(xiàn)軸突丟失和脫髓鞘現(xiàn)象[18]。本研究結(jié)果顯示葉酸干預能有效減少EAE大鼠脊髓的脫髓鞘病灶，且經(jīng)葉酸處理后的EAE大鼠臨床癥狀獲得改善，發(fā)病時間延緩。

以上研究結(jié)果首次證明了葉酸對髓鞘生成和炎性損傷后修復有直接作用，提示了葉酸作為治療MS等脫髓鞘疾病的潛在價值。然而本研究也有一定局限性，無對模擬MS患者體內(nèi)抗體介導的脫髓鞘損傷的作用作進一步研究，葉酸促進CNS髓鞘形成和再生的具體作用機制尚需進一步深入研究，為葉酸作為脫髓鞘疾病治療藥物的可行性提供進一步的理論依據(jù)。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2020-11-30）

（本文編輯：洪悅民）