酪酸梭菌及丁酸鹽對急性壞死性胰腺炎合并肝損傷大鼠的作用及機制研究

嚴清青 賈林 何梓健 黃耀星 李偉冬

1廣州市第一人民醫院(華南理工大學附屬第二醫院)消化內科，廣州 510180；2廣州市番禺中心醫院消化內科，廣州 511400

AP是臨床上常見的急腹癥之一，發病機制復雜，病情進展迅速[1]，特別是進展到SAP階段，體內大量炎癥遞質釋放，可誘發多個胰外器官的損傷[2]。肝臟是SAP患者較早發生損傷的胰外器官[3]。SAP發生后機體迅速出現超高代謝、內環境紊亂、免疫功能降低、營養不良及繼發感染，同時合并菌血癥、感染性壞死、器官功能衰竭等，這些均與腸屏障功能障礙息息相關。研究已證實，腸道菌群紊亂與SAP患者的腸屏障功能障礙和高死亡率有關，同時與多種肝臟疾病的發生、發展及轉歸密切相關[4]。因此，維護腸功能和調節腸道菌群對改善SAP患者的預后極為重要，早期腸內營養支持和給予益生菌治療為常用手段。研究指出，酪酸梭菌(C.butyricum，CB)及其代謝產物丁酸鹽(sodium butyrate，SB)通過減少炎癥因子的釋放調節腸道微生態并維持腸屏障功能的穩定[5]。本研究構建ANP大鼠模型，觀察酪酸梭菌或丁酸鹽干預對ANP大鼠胰腺、肝臟及腸黏膜變化的影響，探討其發生機制。

材料與方法

一、實驗動物及分組

40只SPF級Sprague-Dawley雌性大鼠由南方醫科大學動物中心提供，許可證號SCXK(粵)2016-0041。使用隨機數字表法將大鼠分成正常對照組、ANP組、酪酸梭菌干預組(CB組)、丁酸鈉干預組(SB組)，每組10只。采用經胰膽管注射4.5%牛黃膽酸鈉溶液1 mg/kg的方法構建ANP模型。CB組大鼠于造模前10 d給予酪酸梭菌1×109CFU/ml灌胃，每天1次；SD組大鼠于造模前10 d給予丁酸鈉100 mg·kg-1·d-1灌胃；對照組、ANP組灌入等容積生理鹽水。制模后24 h采用左下腹直接穿刺并連接壓力換能器測定大鼠腹腔內壓[6]。然后對大鼠進行麻醉、剖腹，觀察腹腔內各臟器大體情況，吸取腹水并計量。于腹主動脈取血，取末端回腸組織10 cm，取出肝臟及胰腺組織。各組織部分即置凍存液氮罐冷凍，部分置10%甲醛中固定。

二、方法

1．血清生物化學指標檢測：取各組血標本，以3 000 r/min離心10 min，收集血清，應用全自動生物化學分析儀(奧林巴斯AU5400，日本)檢測血淀粉酶、脂肪酶、AST、ALT、TBil水平。采用ELISA檢測炎癥因子TNF-α、IL-6、高遷移率族蛋白B1(high mobility group box1 protein, HMGB1)水平，試劑盒購自英國abcam公司，嚴格按說明書操作。

2．腸屏障緊密連接蛋白表達檢測：取凍存的各組大鼠回腸組織，加入蛋白裂解液，置于冰上裂解30 min，12 000 g離心15 min，吸取蛋白上清液，用BCA定量試劑盒確定上樣濃度。采用常規蛋白質免疫印跡法檢測緊密連接蛋白ZO-1、claudin-1、occludin表達。抗兔ZO-1、claudin-1、occludin一抗購自英國abcam公司，工作濃度分別為1∶1 000、1∶800、1∶1 000；抗兔二抗購自碧云天公司，工作濃度為1∶2 000，轉移至暗室顯影，根據ECL化學發光檢測試劑盒說明書混合發光液，并按步驟進行顯影，反應底物濃度，隨后采用Image J分析各蛋白表達量。

3．胰腺、肝臟組織病理學檢查：取甲醛固定的各組大鼠胰腺和肝臟組織，常規脫水、石蠟包埋、連續切片、蘇木精-伊紅(HE)染色。由兩位病理科醫師盲法在光鏡下觀察組織的病理學改變，并參照改良Schmidt評價標準[7-8]進行胰腺組織病理評分，肝臟病理評估指標按照Camago等[9]提出的肝臟病理分級內容進行評分。

三、統計學處理

結 果

一、各組大鼠腹腔內壓力變化及腹水量比較

ANP組大鼠腹腔內壓力和腹水量均較對照組明顯增加。CB組、SB組大鼠腹腔內壓力和腹水量均較ANP組明顯減少，但仍高于對照組，差異均有統計學意義，而CB組和SB組間的差異無統計學意義(表1)。

表1 各組大鼠腹腔內壓力和腹水量變化

二、各組大鼠血生物化學指標的變化

ANP組大鼠的血淀粉酶、脂肪酶、AST、ALT、TBil水平均較對照組明顯增高，提示胰腺及肝臟損傷明顯；ANP組血TNF-α、IL-6、HMGB1含量也明顯高于對照組，差異均有統計學意義。CB組和SB組大鼠各項生物化學指標均較ANP組明顯下降，差異也均有統計學意義，而CB組和SB組間的差異無統計學意義(表2)。

三、各組大鼠胰腺、肝臟組織病理學改變

對照組大鼠胰腺組織結構完整，未見組織水腫、腺泡壞死、白細胞浸潤；ANP組大鼠胰腺組織水腫、腺小葉結構紊亂，有大片出血壞死和脂肪壞死，大量白細胞浸潤；CB組和SB組大鼠胰腺組織水腫程度減輕，出血壞死范圍較ANP組縮小，少量白細胞浸潤(圖1)。對照組、ANP組、CB組、SB組大鼠胰腺組織病理評分分別為1.18±0.05、11.20±1.08、9.45±1.06、9.04±0.89，ANP組顯著高于其他3組，CB組和SB組高于對照組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，而CB組與SB組間的差異無統計學意義(P>0.05)。

對照組大鼠肝臟組織未見肝血竇充血和水腫，未見炎性細胞和肝細胞氣球樣變，無出血和點狀壞死或片狀壞死；ANP組大鼠肝臟組織可見肝血竇充血水腫，大量炎性細胞浸潤、肝細胞氣球樣變化，偶可見點狀壞死；CB組和SB組大鼠肝臟組織肝血竇充血水腫程度較ANP組明顯減輕，炎性細胞浸潤減少，偶可見肝細胞氣球樣變，未發現出血和點狀壞死(圖2)。對照組、ANP組、CB組、SB組大鼠肝臟組織病理評分分別為0.56±0.09、2.89±0.73、2.09±0.49、2.12±0.52，ANP組高于其他3組，CB組和SB組高于對照組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，而CB組與SB組間的差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠血生物化學指標的變化

四、各組大鼠腸黏膜緊密連接蛋白表達水平比較

對照組、ANP組、CB組、SB組大鼠腸黏膜組織內ZO-1蛋白表達量分別為1.825、0.79、1.25、1.16；claudin-1蛋白表達量分別為0.58、0.13、0.43、0.37；occludin蛋白表達量分別為1.06、0.38、0.82、0.79。ANP組均顯著低于其他3組，差異均有統計學意義(P值均<0.05，圖3)，而CB組與SB組間的差異無統計學意義(P<0.05)。

注：ANP為急性壞死性胰腺炎；CB為酪酸梭菌；SB為丁酸鹽圖1 對照組(1A)、ANP組(1B)、CB組(1C)和SB組(1D)胰腺組織病理改變(HE染色 ×100)

注：ANP為急性壞死性胰腺炎；CB為酪酸梭菌；SB為丁酸鹽圖2 對照組(2A)、ANP組(2B)、CB組(2C)和SB組(2D)肝臟組織病理改變(HE染色 ×100)

注：ANP為急性壞死性胰腺炎；CB為酪酸梭菌；SB為丁酸鹽圖3 對照組(1)、ANP組(2)、CB組(3)、SB組(4)大鼠回腸組織緊密連接蛋白表達

據報道，超過80%的SAP患者可出現短時間或持續的肝功能異常，而胰腺炎相關肝損傷的發生與SAP早期炎性反應失控密切相關[10]。肝損傷后肝臟清除率及解毒功能下降，各種致病物質更易進入體內循環，為全身炎癥反應綜合征的發生提供了基礎，促進多器官功能障礙形成，可見保護肝臟可延緩多器官功能障礙的發生，提高臨床治愈率[11]。

腸道菌群是宿主共生微生物的大蓄水池，與宿主協同共存，保持著動態平衡，提供有益于宿主的生物和代謝功能，參與保護腸道屏障、營養代謝、調節免疫等過程[12-13]。腸功能障礙是SAP常見并發癥，也是促進病情發展甚至誘發多器官功能障礙的重要原因。腸道功能障礙包括腸黏膜屏障損傷和腸道動力障礙，研究表明腸道菌群可通過影響腸黏膜上皮細胞更新、腸道通透性、腸道抗菌肽的釋放及腸道黏液層等調節腸黏膜屏障功能[14]。近年來，益生菌對各種腸道疾病的治療作用受到極大關注，Bongaerts和Severijnen[12]提出應該在胰腺炎初期應用大量有代謝活性的益生菌，才能起到調節腸道菌群紊亂，減少后期繼發感染，從而改善AP疾病病程。酪酸梭菌是一種常見的腸道共生菌，該菌及其代謝產物丁酸可抑制各種腸道有害細菌發育，減少其增殖及產生毒素，減少炎癥因子釋放，修復腸道屏障并維持其穩定。本研究結果顯示，酪酸梭菌或丁酸鹽干預后大鼠腹腔內壓力、腹水量較未干預組明顯降低，且TNF-α、IL-6水平顯降低，說明酪酸梭菌能有效降低ANP大鼠體內炎癥反應，減輕AP疾病嚴重程度。

目前已有研究報道梭菌族Ⅳ和硬壁菌ⅪVa是腸道中產生短鏈脂肪酸的主要菌，且有證據表面短鏈脂肪酸在減少肝臟炎癥中有一定作用[15]。短鏈脂肪酸不僅可以為機體腸黏膜細胞提供能量，調節腸道PH，還可以維持腸黏膜上皮細胞間緊密連接蛋白的完整性，改善腸黏膜屏障功能[16]。本研究結果表明，酪酸梭菌、丁酸鹽干預組大鼠AST、ALT、TBil水平明顯下降，且ANP組大鼠緊密連接蛋白ZO-1、occludin、claudin1的表達明顯低于對照組，經酪酸梭菌或丁酸鹽干預后ZO-1、occludin、claudin1的表達明顯升高，說明在ANP大鼠模型中酪酸梭菌或丁酸鹽可起到保護肝損傷的作用，補充酪酸梭菌或丁酸鹽可明顯增強腸黏膜屏障功能，改善ANP并發肝損傷的嚴重程度。

總之，酪酸梭菌及其代謝產物丁酸鹽既能減輕ANP合并肝損傷大鼠體內炎癥反應、維護其腸屏障功能，又能明顯緩解ANP大鼠體內肝臟損傷，這一結果為酪酸梭菌治療SAP合并肝損傷提供了實驗依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突