甲基化CpG結(jié)合蛋白2在胰腺癌及癌旁組織中的表達(dá)及臨床意義

謝雨婷 高軍

海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200433

胰腺癌確診困難，80%以上的患者確診時(shí)已經(jīng)是晚期，失去了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。如果想提高胰腺癌患者的生存率，就必須提高患者的早期診斷率，因此尋找早期診斷指標(biāo)，并為生物靶向治療提供依據(jù)是胰腺癌研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)[1-3]。DNA甲基化是影響基因活性的主要表觀遺傳因素[4]，抑癌基因啟動(dòng)子高甲基化被認(rèn)為是癌癥發(fā)生的重要原因[5]。基因組表型遺傳修飾主要包括遺傳物質(zhì)DNA的甲基化修飾和核小體組蛋白修飾，結(jié)果是在DNA堿基不發(fā)生改變的情況下而表型卻發(fā)生了變化。甲基化CpG結(jié)合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2，MeCP2)是能與甲基化DNA結(jié)合的一類核蛋白，可以將DNA甲基化和組蛋白修飾耦合起來(lái)，在表觀遺傳中發(fā)揮著中樞紐帶的作用[6]。既往報(bào)道中，MeCP2與胃癌、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、骨肉瘤等多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)[7-8]，但在胰腺癌中的研究欠缺。本研究應(yīng)用組織芯片，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)胰腺癌組織及其匹配的癌旁正常組織MeCP2的表達(dá)，分析MeCP2表達(dá)與胰腺癌病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性，為深入理解胰腺癌發(fā)生、發(fā)展提供新的思路。

材料與方法

一、MeCP2蛋白表達(dá)檢測(cè)

組織芯片購(gòu)自上海芯超生物科技有限公司(產(chǎn)品批號(hào)：HPan-Ade120Sur-01)，芯片有63份胰腺癌組織，57份癌旁正常胰腺組織。常規(guī)切片后采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)MeCP2蛋白表達(dá)。兔抗人MeCP2多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。將組織芯片切片常規(guī)脫蠟至水，并經(jīng)檸檬酸鹽緩沖液煮沸進(jìn)行抗原修復(fù)。經(jīng)正常山羊血清封閉過(guò)夜后依次孵育MeCP2多克隆抗體和辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗。以DAB為底物顯色后封片。選擇組織結(jié)構(gòu)清晰且染色均勻的胰腺癌組織芯片進(jìn)行結(jié)果分析。免疫組織化學(xué)結(jié)果由2位病理科醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立讀片，并進(jìn)行評(píng)分。每張標(biāo)本在高倍鏡下至少觀察3個(gè)視野，按陽(yáng)性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞比例≤1%為0分，2%～25%為1分，26%～50%為 2分，51%～<75%為3分，≥75%為4分；無(wú)染色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分與染色強(qiáng)度評(píng)分的乘積作為病理學(xué)評(píng)分，<4分為陰性(-)，≥4分為陽(yáng)性(+)[7]。

二、臨床資料

選擇胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰且染色均勻的胰腺癌及癌旁正常胰腺組織芯片，共59例胰腺癌和53例癌旁正常胰腺組織入組。按MeCP2表達(dá)情況將芯片組織分為MeCP2陽(yáng)性組和MeCP2陰性組。59例胰腺癌患者年齡43～81歲，中位年齡62歲，手術(shù)時(shí)間2009年1月至2013年8月，術(shù)前均未接受放、化療或其他抗腫瘤輔助治療。隨訪時(shí)間截至2014年11月。總生存期定義為從患者手術(shù)治療日到患者死亡或者末次隨訪時(shí)間。患者死亡原因排除非胰腺癌的死亡。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、胰腺癌及癌旁組織MeCP2表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性

59例胰腺癌組織中28例MeCP2陽(yáng)性表達(dá)，31例MeCP2陰性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為47.5%；53例癌旁組織中36例MeCP2陽(yáng)性表達(dá)，17例MeCP2陰性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為67.9%(圖1)，癌旁組織的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于胰腺癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.776，P=0.029)。

圖1 胰腺癌組織(1A)及其癌旁組織(1B)中的MeCP2表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色 ×100)

胰腺癌組織MeCP2陽(yáng)性表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、神經(jīng)侵犯、臨床分期均無(wú)顯著相關(guān)性，但有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理Ⅲ級(jí)的胰腺癌組織MeCP2陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)明顯少于陰性表達(dá)例數(shù)，而無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理Ⅱ級(jí)的胰腺癌組織MeCP2陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)明顯多于陰性表達(dá)例數(shù)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

癌旁組織MeCP2陽(yáng)性表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯均無(wú)顯著相關(guān)性，但病理Ⅲ級(jí)胰腺癌的癌旁組織MeCP2陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)明顯少于陰性表達(dá)例數(shù)，而病理Ⅱ級(jí)的癌旁組織MeCP2陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)明顯多于陰性表達(dá)例數(shù)；臨床4期的癌旁組織MeCP2陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)少于陰性表達(dá)例數(shù)，而臨床2期的癌旁組織MeCP2陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)明顯多于陰性表達(dá)例數(shù)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 胰腺癌及癌旁組織MeCP2表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性(例)

二、胰腺癌患者的生存期及預(yù)后因素

胰腺癌組織MeCP2陰性、陽(yáng)性表達(dá)患者的中位總生存期分別為8個(gè)月、10個(gè)月(95%CI7.125～10.875，圖2)；癌旁組織MeCP2陰性、陽(yáng)性表達(dá)患者的中位總生存期分別為8個(gè)月、10個(gè)月(95%CI7.224～10.776，圖3)。無(wú)論是胰腺癌組織還是癌旁組織，MeCP2陽(yáng)性表達(dá)患者的總生存期均顯著長(zhǎng)于陰性表達(dá)患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.027、0.036)。Cox單因素分析結(jié)果顯示，胰腺癌患者預(yù)后與胰腺癌及癌旁組織MeCP2的表達(dá)和病理分級(jí)相關(guān)，即胰腺癌組織MeCP2陽(yáng)性表達(dá)患者的生存期較陰性表達(dá)患者明顯延長(zhǎng)，癌旁組織MeCP2陽(yáng)性表達(dá)患者的生存期較陰性表達(dá)患者明顯延長(zhǎng)，病理Ⅱ級(jí)患者的生存期較病理Ⅲ級(jí)患者明顯延長(zhǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但胰腺癌預(yù)后與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、神經(jīng)侵犯與否、臨床分期等因素?zé)o相關(guān)性(表2)。多因素分析結(jié)果顯示，MeCP2在胰腺癌組織中的表達(dá)是胰腺癌患者預(yù)后評(píng)估的獨(dú)立因素，陽(yáng)性表達(dá)的患者預(yù)后較好(表3)。

圖2 胰腺癌組織MeCP2表達(dá)陽(yáng)性組與陰性組的總體生存曲線

圖3 胰腺癌癌旁組織MeCP2表達(dá)陽(yáng)性組與陰性組的總體生存曲線

表2 59例胰腺癌患者臨床病理參數(shù)與患者預(yù)后的單因素分析

表3 59例胰腺癌患者臨床病理參數(shù)與患者預(yù)后的多因素分析

討 論

DNA甲基化是一種重要且與轉(zhuǎn)錄沉默有關(guān)的表觀遺傳修飾[9]，其對(duì)于DNA的精確調(diào)控至關(guān)重要[4]。MeCP2是與DNA甲基化密切相關(guān)的蛋白，在DNA甲基化中起著非常重要的作用，其功能依賴于識(shí)別和結(jié)合甲基化DNA的能力[9]。MeCP2是包含DNA甲基結(jié)合域的基礎(chǔ)蛋白[10]，招募組蛋白脫乙酰基酶、甲基化酶等到甲基化DNA，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制[11]。有研究表明MeCP2通過(guò)結(jié)合胰腺癌細(xì)胞的甲基化CpG島來(lái)抑制胰腺癌細(xì)胞LIN28A的表達(dá)，而LIN28A的表達(dá)異常與人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[12]，提示MeCP2可能有抑癌效應(yīng)。

既往研究證實(shí)，MeCP2是一種染色質(zhì)結(jié)合蛋白，可介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在大腦中含量很高[13]。Rett綜合征(RTT)是一種嚴(yán)重的進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要影響年輕女性，而MeCP2基因突變是經(jīng)典RTT病例的最普遍原因[14]。MeCP2也與一些精神疾病相關(guān)，例如自閉癥和精神分裂癥[15]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)MeCP2還與乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[16]。本研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織MeCP2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，胰腺癌組織和癌旁組織MeCP2陽(yáng)性表達(dá)患者的生存期較陰性患者長(zhǎng)，說(shuō)明MeCP2陰性則胰腺癌的侵襲性更強(qiáng)；胰腺癌MeCP2陰性表達(dá)組的腫瘤病理分級(jí)更高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也更常見(jiàn)。這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明MeCP2表達(dá)陰性的，腫瘤細(xì)胞可能具有更強(qiáng)的侵襲性，但淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與侵襲性之間有無(wú)聯(lián)系，還需要更多的基礎(chǔ)和臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證。在癌旁組織中，MeCP2表達(dá)陽(yáng)性率與病理分級(jí)和臨床分期相關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性，原因可能與取材位置有關(guān)。生存分析顯示胰腺癌組織MeCP2表達(dá)水平與患者預(yù)后密切相關(guān)，且Cox模型顯示癌組織MeCP2低表達(dá)是胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但在該模型中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移這一臨床特征顯示與患者預(yù)后無(wú)相關(guān)性。預(yù)后是各種影響因素綜合作用的結(jié)果，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移雖然與疾病本身的嚴(yán)重程度、病理分級(jí)等有關(guān)系，但它只是腫瘤預(yù)后的影響因素之一，當(dāng)然也限于此次研究的樣本量。

本研究具有兩個(gè)方面的局限性。首先，這項(xiàng)研究是一個(gè)小樣本量的回顧性研究，結(jié)果表明胰腺癌組織MeCP2高表達(dá)患者病理分級(jí)較低，癌旁組織中MeCP2高表達(dá)患者臨床分期較早，雖然這一結(jié)果具有一定的指導(dǎo)意義，但后續(xù)仍需增加樣本量，以便對(duì)此結(jié)論進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，同時(shí)需要結(jié)合前瞻性研究加以證實(shí)；其次，局限于當(dāng)前的醫(yī)療檢查技術(shù)，胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移早期診斷仍是世界難題，CT、PET-CT容易漏診，現(xiàn)有的腫瘤標(biāo)志物又不能判斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否，故在判別淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否并進(jìn)行分組時(shí)，可能與真實(shí)情況存在偏差。總之，MeCP2表達(dá)在胰腺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用機(jī)制及其評(píng)估預(yù)后的價(jià)值仍不清楚，需要更多的基礎(chǔ)和臨床研究成果進(jìn)行支持。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突