外周血LTA4H基因多態性rs7971150位點檢測在老年慢性阻塞性肺疾病患者中的臨床意義

程煒煒，魯曉怡，周曉莉，劉明，張青，夏娟，趙云峰

1.上海楊思醫院呼吸科，上海200126 2.上海市浦東新區浦南醫院呼吸科，上海200125

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）是呼吸內科常見病，是一種多種炎癥細胞浸潤的呼吸道慢性炎癥性疾病[1]，多見于中老年人，中國40 歲以上人群患病率為13.7%[2]。白三烯是白細胞活化物質，白三烯A4 水解酶（leukotriene A4 hydrolase,LTA4H）是肺部發生慢性炎癥的一個關鍵酶，能夠催化產生白三烯B4（leukotriene B4，LTB4），而LTB4 通過與靶細胞膜上的G 蛋白偶聯受體結合引起氣道炎癥[3-4]。近年來，LTA4H 作為白三烯產成過程中一種重要的限速酶，在有些呼吸系統疾病中對其基因多態性進行了相關的研究[5-6]。LTA4H 上游啟動子的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）rs7971150 影響LTA4H mRNA 在體內的表達[4]，而香煙煙霧可誘導氣道上皮細胞LTA4H 的表達[7]。本研究旨在探討LTA4H基因多態性rs7971150 檢測在老年慢性阻塞性肺疾病患者中的臨床意義,以及其與吸煙的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年9月—2020年1月在上海市浦東新區浦南醫院呼吸科病房和上海楊思醫院呼吸科病房住院的COPD 急性加重（觀察組）患者150 例和非COPD 患者150 例（對照組）。AECOPD 患者均符合2017年GOLD 指南制定的AECOPD 標準，納入標準：COPD 患者主訴癥狀突然變化超過日常變異范圍[8]，具體表現為咳嗽、咳痰、呼吸困難比平時加重，或痰量增多、或咳黃痰，需要改變用藥方案；排除標準：（1）嚴重腎功能、肝功能、心功能不全，血液惡性腫瘤及其他系統腫瘤患者；（2）肺間質性疾病、炎癥性疾病；（3）支氣管哮喘或支氣管擴張癥，遺傳性疾病史；（4）心肌梗死史、心胸及腹部外科大手術史、腦卒中等；（5）傳染性疾病恢復期；（6）孕婦或預計生育的女性；（7）研究者認為不宜納入本項研究的特殊人群。具備上述任1 項標準的病例不納入本研究。

觀察組中男性104 例，女性46 例，年齡在61～75歲(中位62.5 歲)。對照組中男性96 例，女性54 例，年齡在60～77 歲(中位64.8 歲)，包括支氣管擴張急性加重患者80 例、社區獲得性肺炎患者70 例，支氣管擴張急性加重及肺炎標準均符合支氣管擴張及肺炎的有關專家共識及指南[9-10]。根據患者是否吸煙，觀察組患者及對照組患者各自分為吸煙組（吸煙煙齡在10年以上，平均每天20 支）及不吸煙組兩個亞組。觀察組患者吸煙組110 例，不吸煙組40 例；支氣管擴張吸煙組43 例，不吸煙組37 例；肺炎吸煙組40例，不吸煙組30 例。性別、年齡以及是否吸煙在觀察組與對照組之間的差異無統計學意義（>0.05）。入組所有研究對象均簽署知情同意書，本研究已通過上海市浦東新區浦南醫院倫理委員會批準（編號為20170704）。

采用imLDR 多重連接酶SNP 分型檢測技術[11]，檢測所有入選患者外周血TA4Hrs7971150 基因多態性，并測定每位患者動脈血氣（pH 值、PaO2、PaCO2）、肺功能FEV1、FEV1%以及6 分鐘步行距離。

1.2 研究方法

1.2.1 基因位點測定 清晨采集患者空腹外周靜脈血4 mL于EDTA抗凝管中，用試劑盒抽提DNA，置于-20℃冰箱里保存。采用上海天昊生物科技有限公司遺傳分析中心的imLDRTM 多重SNP 分型試劑盒對樣本進行SNP 位點分型[12]。

rs7971150 位點的上游引物序列為5'-GACTCCTGGTCTCAGTTGGGTGA-3'；下游引物序列為 5'-TCCCTTGGATTGTATGCCAAAAA-3'；連接引物序列分 別 為 rs7971150RG: 5'TCTCTCGGGTCAATTCGTCCTTTGAAGGATTTTAAGCAGGGGAGTGACAC-3'；rs7971150RA: 5'-TGTTCGTGGGCCGGATTAGTTGAAGGATTTTAAGCAGGGGAGTGACAT-3'；rs7971150RP: 5'-GATTACATTAGAAAGAATGCTCTAGCAGATAACA-3'。

1.2.2 動脈血氣測定 采用美國Nova Stat Profile M 型血氣生化分析儀(電極法) 測定患者動脈血氣。

1.2.3 肺功能測定 應用意大利生產的COSMED 肺功能儀測定肺功能，記錄患者FEV1、FEV1%等結果。

1.2.4 6 分鐘步行距離的測定 在病房內用米尺事先測定30 米距離，標明起始點位置，每5 米標注數字，記錄患者6 分鐘所行走的距離。

1.3 統計學分析 采用SPSS 19.0 軟件進行統計分析。計量資料以（±s）表示，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以Hardy-Weinberg 平衡定律評估樣本的群體代表性（值>0.05 有意義）。應用直接計數法統計各位點的基因型頻率與等位基因頻率（%），基因型頻率、等位基因頻率的對比采用檢驗。用logistic 回歸方法計算優勢比（odds ratio，OR）及其95%置信區間（confidence interval，CI）。<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料 本研究共納入AECOPD 患者150 例，非COPD 患者150 例（包括支氣管擴張急性加重患者80例、社區獲得性肺炎患者70 例）。經Hardy-Weinberg平衡檢驗，rs7971150 位點的基因型在2 組間分布符合Hardy-Weinberg 平衡，具有群體代表性（P 值為0.696，>0.05 有意義）。本研究rs7971150 位點的基因型分為野生型（AA）、變異雜合子（GA）、變異純合子（GG）。

2.2 2 組rs7971150 位點基因型頻率分析2 組rs7971150位點基因型頻率分布的差異有統計學意義(<0.05);與AA 基因型相比較，GG 基因型顯著增加了患病風險（OR=2.52，=0.0076）。見表1。

表1 2 組rs7971150 位點基因型頻率分析

2.3 2 組rs7971150 位點基因型的亞組分析 在吸煙亞組和不吸煙亞組中，rs7971150 位點基因型頻率在觀察組與對照組之間分布的差異均有統計學意義(<0.05)，且在吸煙亞組中，與AA 基因型相比較，GA、GG 基因型都顯著增加了患病風險（OR=2.16,=0.027；OR=3.21，=0.009）。見表2。

表2 2 組rs7971150 位點基因型的亞組分析

2.4 2 組有關指標的比較 如表3所示，與對照組不吸煙患者pH 值、PaO2、PaCO2、FEV1、FEV1%、6 分鐘步行距離等有關數據相比，對照組吸煙患者上述指標之間的差異均無統計學意義（均>0.05）。

表3 2 組有關指標的比較

與觀察組不吸煙患者pH 值、PaO2、PaCO2、FEV1、FEV1%、6 分鐘步行距離等有關數據相比，觀察組吸煙患者pH 值、PaO2、PaCO2之間的差異均無統計學意義(均>0.05)，而觀察組吸煙患者FEV1、FEV1%、6 分鐘步行距離之間的差異均有統計學意義(均<0.05)。

與對照組（不吸煙、吸煙）患者相比，觀察組患者pH 值、PaO2之間的差異均無統計學意義(均>0.05)；而PaCO2、FEV1、FEV1%、6 分鐘步行距離之間的差異均有統計學意義(均<0.05)。

3 討論

測定基因多態性在闡明人體對疾病的易感性與耐受性、疾病表現的多樣性起著非常重要的作用。研究提示COPD 人群易感性與基因多態性之間存在某種聯系[4]。白三烯刺激白細胞趨化、聚集、釋放氧自由基及溶酶體酶，可增加血管壁通透性，刺激支氣管平滑肌細胞分泌粘液，從而引起支氣管平滑肌收縮，與COPD 的發病機制密切相關[3]。在COPD 發病和疾病進展中，LTA4H 存在高表達。香煙煙霧可誘導氣道上皮細胞LTA4H 的表達[7]，因此LTA4H 基因多態性與香煙煙霧暴露之間存在基因與環境之間的相互作用。長期香煙煙霧刺激不僅引起氣道的慢性炎癥，還能導致氣道上皮細胞增生與凋亡失衡[13]。

本研究顯示：在觀察組與對照組之間，rs7971150位點基因型頻率分布的差異有統計學意義，與AA 基因型相比較，GG 基因型顯著增加了患病風險。在吸煙亞組和不吸煙亞組中，rs7971150 位點基因型頻率在觀察組與對照組之間分布差異均有統計學意義，且在吸煙亞組中，與AA 基因型相比較，GA、GG 基因型顯著增加了患病風險。與觀察組不吸煙患者相比，觀察組吸煙患者pH 值、PaO2、PaCO2之間的差異均無統計學意義，而FEV1、FEV1%、6 分鐘步行距離之間的差異均有統計學意義。與對照組（不吸煙、吸煙）患者相比，觀察組患者pH 值、PaO2之間的差異均無統計學意義；而PaCO2、FEV1、FEV1%、6 分鐘步行距離之間的差異均有統計學意義。以上研究結果說明：通過LTA4H 基因多態性rs7971150 位點測定，GA 基因型、GG 基因型顯著增加了COPD 患病風險，GA基因型、GG 基因型突變與COPD 患者發病有關。吸煙的COPD 患者存在明顯的GA、GG 突變基因型，吸煙是導致吸煙者發生COPD 的重要原因，與不吸煙的COPD 患者相比，吸煙的COPD 患者存在更差的肺功能、更短的6 分鐘步行距離。

綜上所述，通過LTA4H 基因多態性rs7971150 位點測定，GA 基因型、GG 基因型顯著增加了COPD患病風險。吸煙的COPD 患者存在明顯的GA、GG突變基因型，以及較差的肺功能、較短的6 分鐘步行距離。本研究不足之處是小樣本、單中心研究，以后要進行大樣本、多中心的臨床研究，為以后在臨床上從基因層面測定患者外周血rs7971150 位點基因多態性，配合肺功能早期篩查、早期確診COPD 提供科學依據。