基于網絡藥理學研究皂角刺治療乳腺癌的作用機制

權 琦 陳 平 黃圓圓 張 蓓

中山大學腫瘤防治中心中醫科，廣東廣州 510060

乳腺癌是女性最常見的腫瘤。2018年全球乳腺癌新發病例數為208.9萬，死亡人數為62.7萬，均居女性惡性腫瘤第1位[1]。晚期乳腺癌的治療方式為化療、放療及靶向治療，但治療相關不良反應多，影響患者的生活質量。中醫藥治療乳腺癌在扶正、祛邪、調動機體抗病能力、減輕其他治療的副作用方面有獨特優勢。中藥聯合放化療能提高患者的治療有效率、減輕不良反應、改善生活質量[2-3]。

皂角刺（Gleditsiae Spina）始載于《本草衍義補遺》，性溫味辛，歸肝、肺、胃經，具有消腫托毒、排膿、殺蟲等功效[4]。現代藥理研究發現，皂角刺中黃酮類成分在多種實體瘤中有抑制腫瘤生長的作用，皂角刺單藥或聯合其他中藥對人乳腺癌細胞有具有細胞毒活性[5-6]。目前關于皂角刺抗腫瘤作用的研究主要集中在細胞或動物實驗層面，缺乏更深層的機制研究。

網絡藥理學是將藥物作用靶點和疾病靶點結合，建立疾病、靶點、藥物及通路之間的相互作用網絡，從而全面系統地分析藥物的作用機制[7]。網絡藥理學可系統揭示中藥的活性成分及作用機制，反映中藥“多成分-多靶點-多途徑”的特點，與中醫治療疾病的整體觀念和辨證論治理論相一致[8]。本研究運用網絡藥理學方法分析皂角刺治療乳腺癌的潛在關鍵靶點及通路，為進一步深入研究提供依據。

1 材料與方法

本研究流程見圖1。

圖1 預測皂角刺治療乳腺癌作用機制流程圖

1.1 皂角刺活性化學成分及作用靶點

在Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database（TCMSP）[9]中，以“皂角刺”為關鍵詞，口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18 為篩選條件，得到活性較高的化合物，并查詢對應的靶點。

1.2 乳腺癌的相關疾病靶點

在Genecards[10]及Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）[11]中，以“breast cancer/carcinoma/neoplasms”為關鍵詞，檢索乳腺相關的靶基因。

1.3 基因映射

利用Venn Diagram 數據包將皂角刺活性化學成分所對應的靶點與乳腺癌相關靶點取交集，得到共同靶點。

1.4 構建PPI

借助String 數據庫平臺[12]構建PPI，獲取靶蛋白相互作用關系圖。

1.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

使用R語言對皂角刺和乳腺癌共同靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，得到皂角刺治療乳腺癌涉及的關鍵功能及通路。

1.6 構建“成分-靶點”和“靶點-通路”網絡

將共同靶點導入Cytoscape 軟件，構建“成分-靶點”網絡圖。將關鍵通路和富集在該通路中的蛋白導入Cytoscape 軟件，構建“靶點-通路”可視化網絡，并提取關鍵靶點涉及的子網絡。

2 結果

2.1 皂角刺的化學成分及靶點結果

篩選得到高活性化合物11個（表1），對應的靶點174個。

1.3 稻瘟病抗性基因的分子標記 利用Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pi21抗性基因引物檢測材料，引物名稱、序列及其擴增片段預期大小見表 1。

表1 皂角刺含有的11種活性化合物基本信息

2.2 乳腺癌的相關疾病靶點結果

Genecards 數據庫和OMIM 數據庫分別檢索出乳腺癌相關的疾病靶點1053 和527個。去除重復的共1132個。

2.3 基因映射結果

將皂角刺活性化學成分所對應的靶點與乳腺癌的疾病相關靶點進行映射，得到映射靶點88個（圖2）。

圖2 皂角刺活性成分-抗乳腺癌作用靶點韋恩圖

2.4 PPI

通過String 平臺獲得PPI網絡（圖3A），篩選出前30名的關鍵靶點（圖3B）。

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結果

以P＜0.01 為篩選標準，獲得GO 生物學過程條目104條，KEGG 相關信號通路144條。GO富集結果提示，皂角刺作用于乳腺癌涉及的分子功能主要包括：細胞因子受體結合、DNA 結合轉錄激活劑活性和RNA 聚合酶Ⅱ特異性激酶調節活性、受體配體活性、泛素樣蛋白連接酶結合、激酶調節活性等（圖4A）。KEGG通路富集結果提示，靶點主要富集于各種癌癥、感染、細胞凋亡和TNF信號通路等（圖4B）。

圖3 PPI

2.6 構建“成分-靶點”和“靶點-通路”網絡結果

在“成分-靶點”網絡圖中（圖5），網絡拓撲結構分析得出各節點degree值，排名前5位的化合物是：槲皮素（quercetin）、非瑟酮（fisetin）、山奈酚（kaempferol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（stigmasterol）。“靶點-通路”網絡圖中（圖6）中，關鍵靶點有3個富集在關鍵通路中，靶點依次為：MAPK1、AKT1、RELA，通路包括癌癥、細胞凋亡、TNF信號通路、感染、IL-17 信號通路和內分泌抵抗。

圖4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

3 討論

本研究通過網絡分析獲得3個關鍵化合物：槲皮素、非瑟酮和山奈酚，均為黃酮類化合物。皂角刺中的黃酮類化合物能從多個方面抑制乳腺癌的發生和發展[13]。有研究報道，槲皮素能將腫瘤細胞周期阻滯在S期并導致腫瘤細胞凋亡[14]。非瑟酮可以激活半胱氨酸蛋白酶，抑制AuroraB 激酶，促進乳腺癌細胞凋亡[15]。Azevedo 等[16]報道，山柰酚對人乳腺癌MCF-7 細胞有抗增殖和細胞毒效應。由此可見，皂角刺中多種活性成分可抑制乳腺癌細胞生長，從而發揮治療乳腺癌的作用。

本研究結果顯示，MAPK1、AKT1、RELA是皂角刺治療乳腺癌的關鍵靶點。MAPK1 又稱ERK2，是Ras/Raf/ERK 通路中較為重要的因子，ERK2 蛋白在乳腺癌中陽性表達率較高[17]，可通過促進細胞凋亡、血管新生和介導耐藥等促進腫瘤發展，抑制ERK2是一種具有潛力的治療靶點。AKT 在乳腺癌等多種惡性腫瘤中以異常活化形式存在，可促進腫瘤細胞增殖，是抗乳腺癌藥物研發的重要靶點[18]。核因子RELA（p65）是NF-κB家族成員，在受到信號刺激進入細胞核后調控下游基因，激活細胞核內基因的轉錄功能引起細胞增殖。研究表明，沉默p65 基因可使乳腺癌細胞增殖受抑制，并能夠引起細胞凋亡，P65 蛋白在乳腺癌組織中陽性表達率較高，且與不良預后密切相關[19-20]。

圖5 “成分-靶點”網絡

圖6 “靶點-通路”網絡圖

根據本研究結果預測皂角刺治療乳腺癌的作用機制為：槲皮素、非瑟酮、山奈酚，通過靶向癌癥、細胞凋亡、TNF信號通路、感染、IL-17信號通路和內分泌抵抗等通路的MAPK1、AKT1、RELA 靶點起作用。

本研究利用生物信息學大數據分析的優勢，通過相關網絡圖的構建直觀地顯示皂角刺治療乳腺癌具有多靶點、多途徑共同作用的特點。研究結果為一種分子機制上的預測探討，具體作用機制的確認需進一步驗證。在后續研究中擬進一步探討皂角刺在復方用藥中抗乳腺癌的作用機制，并對核心靶點和機制進一步做實驗驗證，為皂角刺在乳腺癌治療中的作用提供更有效、更深入的論證。