菊淀粉型巴戟天寡糖抗創傷后應激障礙行為學評價

王運慧，尹勇玉，姚俊祺，劉文剛，袁 瑾，張黎明，李云峰，4

（軍事科學院軍事醫學研究院1.毒物藥物研究所，4.軍事認知與腦科學研究所，北京100850；2.抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京100850；3.中國人民解放軍醫學院，北京100853）

創傷后應激障礙（post-traumatic stress disorder，PTSD）作為最常見的精神疾病之一，往往在目睹或經歷威脅生命的事件后發生，如戰爭、自然災害、恐怖襲擊、重大事故或襲擊等［1］。PTSD 核心癥狀包括創傷事件的反復再現、回避與應激事件有關的記憶、認知和情緒的負性改變以及過度興奮和警覺［2］。PTSD終生患病率約為3.9%［3］，女性患PTSD的風險遠高于男性，且會出現更嚴重的PTSD 癥狀［4］。PTSD 與抑郁癥、焦慮癥和物質濫用等疾病共患率高［5］，是自殺的主要原因之一。PTSD 的治療主要包括心理干預治療和藥物治療［6］。目前美國FDA批準用于抗PTSD的藥物僅為選擇性5-羥色胺重攝取抑制劑舍曲林（sertraline，Ser）和帕羅西汀［7］，但均屬于抗抑郁藥擴大適應證治療藥物，且該類藥物存在起效慢（4～6周）、有效率低（約50%）和不良反應多（如損傷認知、導致性功能障礙和代謝紊亂）等嚴重缺陷［8］。因此，尋找新的副作用低的防治PTSD藥物尤為重要。

中醫藥因其整體調節的特點在復雜精神疾病治療中具有廣闊前景。中藥巴戟天為茜草科植物巴戟天（Morinda officinalis How.）的干燥根，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕之功效，還具有提高機體免疫力、調節內分泌和抗抑郁等作用［9］。巴戟天化學成分較復雜，主要包括糖類、蒽醌類、環烯醚萜苷類、有機酸類、氨基酸、微量元素和甾醇類［10］等。菊淀粉型巴戟天寡糖（inulin-type oligosaccharides of M. officinalis，IOMO）是從巴戟天中提取的、以水溶性菊淀粉型3～9 聚寡糖為主的抗抑郁有效部位。作者所在研究團隊首次發現IOMO 具有抗抑郁活性［12］，其機制與增強腦神經營養［13］和神經保護［14］密切相關。巴戟天寡糖膠囊（國藥證字Z20120007）于2012 年上市至今，為我國目前唯一的中藥5 類（新1 類）抗抑郁中藥，主要用于臨床輕中度抑郁癥治療。該藥臨床療效與一線化學藥氟西汀相當，未見不良反應，兼有增強免疫［15］、調節睡眠等作用。研究表明，巴戟天糖類成分還具有多種生物活性，包括保護神經細胞［14］、抗骨質疏松癥［16］、抗疲勞［17］、抗氧化、降血糖［18］和抗阿爾茨海默病［19］等。然而，目前僅有1篇文獻報道巴戟天寡糖可能具有潛在的抗PTSD活性［20］，尚未得到系統證實。

本研究運用大鼠單次延長應激（single prolonged stress，SPS）模型和小鼠不可逃避足底電擊（ines?capable electric foot-shock，FS）模型，通過相關行為學實驗評價巴戟天寡糖ig 給藥的抗PTSD 效應，旨在為抗PTSD新藥研發及機制研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

IOMO 原料藥（類白色至淺黃色粉末，味甜，生產批號：20190315，由北京同仁堂股份有限公司提供），主要制備過程：中藥巴戟天經水提取后用活性炭吸附，然后水清洗，乙醇洗脫、濃縮、噴霧干燥制成。經化學及波譜學方法鑒定，4 個糖類成分分別為耐斯糖（四糖）、1-果呋喃糖基耐斯糖（五糖）、菊淀粉型寡糖6 聚合體（六糖）和菊淀粉型寡糖7 聚合體（七糖），具體鑒定方法見文獻［11］；質控標準：3～9聚寡糖含量53%～70%，其中5 聚糖含量≥6%。Ser 原料藥（白色粉末，生產批號：H1929183，純度＞98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。電子分析天平（德國Sartrious 公司）；聚丙烯嚙齒類動物限制錐、大鼠和小鼠開場實驗箱及大鼠和小鼠高架十字迷宮裝置（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；國產條件性恐懼箱（北京眾實迪創科技發展有限責任公司）。

1.2 實驗動物

SPF級雄性SD 大鼠，體重170～190 g，購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0010；SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠，體重18～20 g，購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0002。大鼠每籠3只、小鼠每籠5 只飼養，自由進食飲水，飼養環境溫度為20～24℃，濕度為40%～60%，12 h黑暗/白晝交替照明（光照時間為8∶00～20∶00），適應性飼養7 d后開始實驗。

1.3 大鼠SPS模型

1.3.1 大鼠分組和SPS模型制備

大鼠分為正常對照組、模型組、模型+Ser 15 mg·kg-1組和模型+IOMO 12.5，25 和50 mg·kg-1組，Ser 和IOMO 從實驗第2 天開始ig 給藥，給藥容積為2 mL·kg-1，每天1 次，共給藥16 d。行為學實驗于給藥后1 h 開始。SPS 模型制備包括3 步：①束縛，將大鼠固定于干凈的聚丙烯嚙齒類動物固定器里2 h；②游泳，大鼠束縛結束后，立即放入水溫為24℃、水深30 cm 的游泳缸內游泳20 min；③麻醉，經15 min 的恢復期后，將大鼠放入裝有乙醚浸濕棉球的自制玻璃缸內，直至大鼠失去意識后取出，待大鼠恢復意識后放回籠中繼續飼養［21］。SPS模型的制備和行為學實驗流程如圖1所示。每只大鼠實驗結束后立即清理糞便，并用30%乙醇擦拭實驗箱，避免排泄物和氣味對下一只實驗大鼠的影響。

1.3.2 場景恐懼實驗

實驗第13 天進行條件性恐懼訓練。將大鼠放于電擊箱，適應3 min 后，給予不可逃避的足底電擊（0.8 mA，持續4 s）［21］。24 h 后進行場景重現，將大鼠再次置于同一電擊箱中且不給予任何刺激，用動物行為視頻分析系統對大鼠5 min 內的僵住時間進行記錄和分析統計。僵住行為即除呼吸以外，身體和頭部完全靜止的狀態。

1.3.3 開場實驗（open field test，OFT）

Fig.1 Schedule of treatment and behavioral tests for single prolonged stress（SPS）model in rats.Rats were ig given sertraline（Ser，15 mg·kg-1），inulin-type oligosaccharides of M. officinalis（IOMO）12.5，25 and 50 mg·kg-1 or water（normal control and model group）from the first day after the SPS procedure once per day for 16 d.OFT：open field test；EPMT：elevated plus maze test.

實驗第15 天大鼠進行OFT。大鼠置于實驗箱（100 cm×100 cm×48 cm，底部等分為16 小格）的角落，自由活動5 min。采用Smart 視頻分析軟件對大鼠運動距離進行統計，以反映大鼠的自發活動。同時對大鼠進入中央區的潛伏期和累計次數進行統計，以反映大鼠的焦慮樣行為。

1.3.4 高架十字迷宮實驗（elevated plus maze test，EPMT）

將大鼠面對閉臂區放于高架十字迷宮裝置的中央區，用Smart 視頻分析軟件觀察記錄5 min 內大鼠分別進入開臂區和閉臂區的累計時間和次數，分析大鼠在開臂區停留時間和進入次數占開臂區和閉臂區總時間和總次數的百分比。

1.4 小鼠FS模型［22］

1.4.1 小鼠分組和FS模型制備

小鼠分為正常對照組、模型組、模型+Ser 15 mg·kg-1組和模型+IOMO 25 和50 mg·kg-1組，Ser 和IOMO 于 第1 天 電 擊 后 開 始ig 給 藥，每 天1 次，共給藥15 d，給藥容積為20 mL·kg-1。實驗箱中配置一個有機玻璃室（30 cm×23.5 cm×25 cm）、不銹鋼電網地板（間隔8 mm）、攝像頭、揚聲器和燈，使用全數字多功能刺激器通過電網地板實現足底電擊。將小鼠置于室內，經過5 min 適應期，連續2 d，每天給予15次間歇性不可逃避的足部電擊（強度0.8 mA，間隔10 s，每次持續10 s，共持續5 min）［23］。正常對照組放置在相同的玻璃室內10 min，無電擊刺激。足底電擊和相關行為實驗流程如圖2所示。

1.4.2 場景恐懼實驗

實驗第10 和15 天，分別對小鼠場景恐懼僵住時間進行測試。將實驗小鼠置于原足底電擊刺激箱內，不給予任何刺激。用動物行為視頻分析系統，對5 min 內小鼠的僵住時間進行記錄和統計分析，以評價小鼠對創傷相關線索的反應。

1.4.3 開場實驗

于第12天進行OFT。小鼠置于實驗箱（60 cm×60 cm×16 cm，底部等分為16 小格）的角落，自由活動5 min，記錄跨格次數（四肢全部跨進同一個格子）和直立次數（2 只前爪從地板上抬起），以反映小鼠的自發活動。同時記錄5 min 內小鼠進入中央區（中間4格）的潛伏期、累計時間和次數，以反映小鼠的焦慮樣行為。

1.5 統計學分析

實驗結果數據用x±s 表示，采用GraphPad Prism 8.0.1 進行數據分析和繪圖。采用單因素方差分析和Dunnett t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠SPS模型

2.1.1 IOMO對SPS模型大鼠場景恐懼行為的影響

實驗第14天進行大鼠的場景恐懼測試，結果如圖3所示。與正常對照組相比，模型組大鼠僵住時間顯著增加（P＜0.01），提示大鼠處于恐懼狀態。與模型組相比，模型+Ser 15 mg·kg-1組大鼠僵住時間顯著降低（P＜0.01），模型+IOMO 12.5和50 mg·kg-1組大鼠僵住時間同樣顯著降低（P＜0.05），而模型+IOMO 25 mg·kg-1組無明顯變化。上述結果提示，IOMO對SPS模型大鼠場景恐懼行為有抑制作用。

2.1.2 IOMO對SPS模型大鼠自發活動的影響

實驗第15 天采用OFT 檢測各組大鼠自發活動，結果如圖4 所示。各組大鼠運動距離均無顯著差異，提示IOMO 治療對SPS 模型大鼠自發活動無明顯影響。

2.1.3 IOMO對SPS模型大鼠焦慮樣行為的影響

Fig.2 Schedule of treatment and behavioral tests for inescapable electric foot shock（FS）model in mice. The mice were ig given Ser 15 mg·kg-1，IOMO（25 and 50 mg·kg-1）or water（normal control and model groups）from the first day after FS procedure once per day for 15 d.

Fig.3 Effect of IOMO on freezing behaviors in SPSexposed rats. See Fig.1 for the rat treatment. The freezing time was recorded on the 14th day after SPS procedure.±s，n=7-8. ＊＊P＜0.01，compared with normal control group; #P＜0.05，##P＜0.01,compared with model group.

Fig.4 Effect of IOMO on locomotor activity on OFT in SPS-exposed rats. See Fig.1 for the rat treatment. On the 15th day after SPS procedure, the travel distance on OFT was recorded.±s，n=8.

實驗第15天進行OFT，結果如圖5所示。與正常對照組相比，模型組大鼠進入開場中央區的潛伏期顯著延長（P＜0.05），次數顯著減少（P＜0.01）。與模型組相比，模型+Ser 15 mg·kg-1組大鼠進入中央區的潛伏期顯著縮短（P＜0.05），且進入中央區次數顯著增加（P＜0.05）；模型+IOMO 50 mg·kg-1組大鼠進入中央區的潛伏期同樣顯著縮短（P＜0.05），進入中央區次數增加（P＜0.05）。由此提示，IOMO 50 mg·kg-1可改善SPS模型大鼠的焦慮樣行為。

2.1.4 IOMO 對SPS 模型大鼠EPMT 焦慮樣行為的影響

實驗第16 天進行EPMT，結果如圖6 所示。各組大鼠進入開臂區和閉臂區的總時間和總次數均無明顯差異。模型組大鼠在開臂區停留時間百分比和進入開臂區次數百分比較正常對照組均顯著減少（P＜0.05）。與模型組大鼠相比，模型+Ser組大鼠在開臂區停留時間百分比（P＜0.01）和進入開臂區次數百分比顯著增加（P＜0.05），模型+IOMO 50 mg·kg-1組大鼠在開臂區停留時間百分比（P＜0.05）和進入開臂區次數百分比也顯著增加（P＜0.05）。提示在EPMT中，IOMO 50 mg·kg-1對SPS模型大鼠焦慮樣行為具有改善作用。

Fig.5 Effect of IOMO on anxiety-like behaviors on OFT in SPS-exposed rats. See Fig.1 for the rat treatment. On the 15th day after SPS procedure，the latency（A）and the total number of times（B）rats entered into in the central area were recorded.±s，n=8. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model group.

2.2 小鼠FS模型

2.2.1 IOMO對FS小鼠場景恐懼記憶的影響

實驗第10 和15 天分別測試FS 模型小鼠的僵住時間，結果如圖7所示。與正常對照組相比，模型組小鼠足底電擊可顯著延長僵住時間（第10 天，P＜0.01；第15 天，P＜0.05），提示模型小鼠處于恐懼狀態。與模型組相比，模型+Ser 15 mg·kg-1組在第10 天和第15 天小鼠的僵住時間均顯著縮短（P＜0.01）；而連續給藥10 d，模型+IOMO 50 mg·kg-1組亦縮短（P＜0.05）；繼續給藥至第15 天，模型+IOMO 25 和50 mg·kg-1組小鼠僵住時間亦顯著縮短（P＜0.05）。提示IOMO 對FS 模型小鼠場景恐懼行為具有抑制作用。

2.2.2 IOMO對FS小鼠自發活動的影響

實驗第12 天采用OFT 檢測各組小鼠自發活動，結果如圖8 所示。各組小鼠跨格次數和站立次數均無顯著性差異，表明IOMO對FS模型小鼠自發活動無影響。

2.2.3 IOMO對FS小鼠焦慮樣行為的影響

Fig.6 Effect of IOMO on anxiety-like behaviors on EPMT in SPS-exposed rats. See Fig.1 for the rat treatment. On the 16th day after SPS procedure，total time（A），total number of times（B），percentages of time in open arms（C）and times in the open arms（D）were recorded.±s，n=7-8. ＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model group.

OFT 結果顯示（圖9），與正常對照組相比，模型組小鼠進入中央區的潛伏期顯著延長（P＜0.05），進入中央區的次數和在中央區停留時間顯著減少（P＜0.05）。與模型組相比，模型+Ser 15 mg·kg-1組小鼠進入中央區的潛伏期顯著縮短（P＜0.05），進入中央區次數和累計時間顯著增加（P＜0.01）。模型+IOMO 50 mg·kg-1組小鼠進入中央區的潛伏期顯著縮短（P＜0.05），進入中央區的次數（P＜0.01）和累計時間顯著增加（P＜0.05）。提示在OFT 中，IOMO 50 mg·kg-1對FS小鼠焦慮樣行為具有改善作用。

Fig.7 Effect of IOMO on freezing time on the 10th day（A）and 15th day（B）in FS-exposed mice. See Fig.2 for the mouse treatment.±s，n=7-8. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

Fig.8 Effect of IOMO on locomotor activity on OFT in FS-exposed mice. See Fig.2 for the mouse treatment. On the 12th day after FS procedure, the numbers of crossing (A)and rears(B)on OFT were recorded.±s，n=7-8.

Fig.9 Effect of IOMO on anxiety-like behaviors on OFT in FS-exposed mice. See Fig.2 for the mouse treat?ment. On the 12th day after FS procedure, the latency (A), the number of entries (B) and total time (C) entered in the central area were recorded.±s，n=7-8. ＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

3 討論

本研究采用大鼠SPS 模型和小鼠FS 模型模擬PTSD 樣行為，表現為模型動物場景恐懼行為和焦慮樣行為增加，自發活動性未見顯著影響。而慢性ig給予IOMO 50 mg·kg-1可顯著改善SPS模型大鼠和FS 模型小鼠的焦慮和場景恐懼行為，與一線抗PTSD藥物Ser作用相似。

已有研究表明，大鼠SPS 模型可以誘導PTSD相關的行為和神經生物學表型［24］。本研究首先通過對大鼠進行2 h 束縛、20 min 強迫游泳以及乙醚麻醉模擬動物心理、生理和內分泌方面的應激，建立大鼠SPS模型［25］。研究表明，SPS模型大鼠場景恐懼行為明顯增加，表現為僵住行為顯著增加。OFT 通過把動物置于新環境中觀察分析其行為改變，以評價其焦慮樣情緒［26］。有研究顯示，SPS 模型在OFT中誘發焦慮行為［27］。在本研究中，SPS模型大鼠進入中央區的潛伏期顯著增加，進入中央區的累計次數顯著減少，與文獻報道的結果一致［28］。EPMT 是最常用的檢測嚙齒類動物焦慮行為的模型，有研究顯示，SPS 模型在EPMT 中同樣誘發焦慮行為［27］。本研究結果發現，SPS 模型大鼠在開臂區停留的時間百分比和進入開臂區的次數百分比均顯著降低，提示SPS 模型誘導大鼠產生焦慮樣行為。本研究發現，SPS 模型不會對大鼠的自發活動產生顯著影響，也與先前研究結果［29］一致。本研究中IOMO 12.5 和50 mg·kg-1顯著降低模型大鼠的僵住時間，而IOMO 25 mg·kg-1則無此作用，結合本研究其他指標和實驗，認為這可能與該組動物的個體差異有關，有待進一步驗證。

研究表明，小鼠FS 模型可誘發持久性的PTSD樣表型，如過度警覺、持續性回避和睡眠障礙等［30］。足底電擊以及情景提示可導致小鼠場景恐懼的產生，表現為僵住行為顯著增加［31］。在電擊后數周內，與足底電擊相關的場景恐懼測試不會影響小鼠的自發活動［32］，提示小鼠在場景恐懼測試中表現的僵住行為不是通過影響運動活性而產生的［33］。本研究發現，小鼠因足底電擊和場景恐懼測試表現出僵住和焦慮樣行為，同時對小鼠的自發活動無影響，與文獻報道一致。有研究表明，在OFT 中，FS模型小鼠進入中央區次數、停留時間和運動距離顯著降低［21］，本研究結果也與文獻報道一致。

本研究中，陽性藥Ser 的劑量在大鼠和小鼠上均采用15 mg·kg-1，該劑量是文獻報道大、小鼠模型 評 價 抗PTSD 效 應 的 有 效 劑 量［21，31，34-36］。相 同劑量Ser 在大、小鼠上產生相似效應的現象，可能與Ser 在行為學實驗中通常表現出U 型劑量-效應關系有關。IOMO 的劑量選擇為12.5，25 和50 mg·kg-1，是依據IOMO 抗抑郁有效劑量和預實驗結果設定的［12，37-38］。

綜上，IOMO 對PTSD 樣行為具有改善作用，可增強模型動物對創傷應激的適應能力。本研究為擴大其臨床適應證提供了重要依據，而其抗PTSD的作用機制還需進一步研究。