抵擋丸加味雞血藤通過PI3K/AKT信號通路抑制結直腸癌上皮間充質轉化

薛霧松，劉仍海

結直腸癌(colorectal cancer， CRC)是成人最常見的惡性腫瘤之一，在全球癌癥相關死亡主要原因中排名第三位[1]。約1/3的CRC患者確診時已處于進展期，失去了最佳手術時機[2]。肝轉移是導致CRC患者死亡的最主要因素[3-4]。因此探索CRC發展和肝轉移的分子機制，將有助于發現用于開發早期診斷和有效治療靶點的生物標志物[5]。

現代中醫理論認為，濕熱邪毒是腫瘤發生、發展的重要原因之一。結腸癌的發生是由于機體正氣不足，脾失健運，氣機不暢，邪毒侵入，濕熱蘊結，局部氣血運行不暢，濕毒瘀凝下注于腸，滯留積聚所致。《傷寒論》中記載，抵擋丸加味雞血藤可起到“祛瘀通絡，活血攻毒”的療效。已有研究表明，魚藤酮能夠顯著抑制CRC細胞在裸鼠體內的生長，其通過阻斷PI3K/AKT信號通路活性抑制Lovo和SW480結腸癌細胞在體內外的增殖和轉移能力，誘導其凋亡[6]。抵擋丸加味雞血藤提取物中含有魚藤酮，本研究擬探討抵擋丸加味雞血藤對CRC發病和轉移的療效和機制，為其治療提供新的分子靶點；深化中醫藥預防和治療CRC發病及肝轉移的機制，為臨床治療提供新藥和指導法則。

1 材料與方法

1.1實驗動物和細胞 ①實驗動物：7～8周齡SPF級雌性裸鼠18只(北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號：JDF-IRB-2020003801)。小鼠飼養環境溫度為(22±2)℃，濕度55%±15%，12 h明暗光照循環。小鼠自由進食。②實驗細胞：SW620細胞購自ATCC，培養條件為加有10%胎牛血清(FBS)的Leibovitz's L-15培養基，37℃、5% CO2培養箱中傳代培養。

1.2實驗材料 FBS和Leibovitz's L-15培養基購自Gibco公司；CCK8檢測試劑盒、凋亡檢測試劑盒、RIPA裂解緩沖液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測試劑盒、原位缺口末端標記法(TUNEL)凋亡試劑盒，均購自Beyotime Biotechnology；抗E-cadherin、N-cadherin、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT購自CST。抵擋丸加味雞血藤為“抵擋丸”(水蛭9 g，虻蟲9 g，桃仁6 g，大黃15 g)加味雞血藤9 g制成。

1.3CCK8細胞增殖檢測 將SW620細胞(上海奧陸生物科技)以每孔2×103個，接種到96孔板中，分別培養1、2、3和4 d。然后，向每個孔中加入10 μl的CCK8溶液，并通過酶標儀測量450 nm處的吸光度。

1.4免疫蛋白印跡 CRC細胞系SW620經抵擋丸加味雞血藤和PI3K抑制劑LY294002處理48 h后，收集細胞，裂解后經免疫蛋白印跡法檢測p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、E-cadherin和N-cadherin表達情況。具體操作步驟如下：使用RIPA裂解緩沖液分離SW620細胞的蛋白質，使用BCA蛋白測定試劑盒測量蛋白質的濃度。蛋白質在10%十二烷基硫酸鈉-丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上分離，并轉移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉膜1.5 h。然后用抗E-cadherin、N-cadherin、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT孵育PVDF膜。洗滌3次后，將膜與辣根過氧化物酶-酶耦聯的二抗體孵育。使用iBright成像系統對條帶進行可視化和定量。β-肌動蛋白作為內部對照。E-Cadherin和N-Cadherin在提取蛋白后需超聲處理。

1.5Annexin-V/PI細胞凋亡檢測 凋亡檢測試劑盒測定凋亡細胞。將細胞以300×g離心5 min，并用預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，添加結合緩沖液195 μl到細胞中，隨后加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl的PI在25℃下避光孵育20 min。通過流式細胞術測定細胞凋亡比例。

1.6免疫熒光染色 免疫熒光檢測SW620細胞E-cadherin、N-cadherin表達情況。細胞經過抵擋丸加味雞血藤組(1000 μg/ml)和LY294002組(500 nmol/L)處理48 h以后，加入4%多聚甲醛固定30 min，用PBS洗滌2次后，E-cadherin、N-cadherin抗體于4℃孵育過夜，次日經PBS洗滌3次后，加入FITC標記的二抗于室溫孵育1 h，PBS洗滌3次后封片，經熒光顯微鏡拍照。每片隨機選取3個視野經IPP統計熒光強度。

1.7CRC荷瘤小鼠及分組 每只裸鼠背部接種SW620細胞2×106個，待腫瘤體積達約50 mm3時，隨機分為對照組、抵擋丸加味雞血藤組和LY294002組，每組6只。對照組給予生理鹽水灌胃;抵擋丸加味雞血藤組給予抵擋丸加味雞血藤100 mg/kg灌胃；LY294002組給藥劑量為10 mg/kg(藥物含量/小鼠體重)，每周3次，持續2周。腫瘤體積計算方式為：腫瘤體積=1/2×a(長徑)×b2(短徑)。

1.8腫瘤組織中的細胞凋亡檢測 TUNEL凋亡檢測試劑盒用于檢測腫瘤組織中的細胞凋亡情況。腫瘤組織經冷凍切片，片厚8 μm，經4%多聚甲醛固定30 min，用PBS洗滌2次，然后按說明書染色孵育顯色，最后拍照。每只小鼠腫瘤組織切片隨機選取3個視野，統計TUNEL標記陽性細胞數量。

2 結果

2.1抵擋丸加味雞血藤對細胞增殖和凋亡的影響

2.1.1細胞增殖情況比較：與對照組比較，CRC細胞系SW620經抵擋丸加味雞血藤和PI3K抑制劑LY294002處理后，細胞生長速率減緩。培養第4天，抵擋丸加味雞血藤組與LY294002組SW620細胞增殖速率顯著性低于對照組(P<0.05)；但抵擋丸加味雞血藤組與LY294002組SW620細胞生長速率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 3組SW620細胞增殖的抑制作用比較與對照組比較，aP<0.05

2.1.2細胞凋亡情況比較：與對照組比較，抵擋丸加味雞血藤組及LY294002組處理48 h后CRC細胞系SW620細胞凋亡比例顯著性升高(P<0.05)；抵擋丸加味雞血藤組與LY294002組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2、3。

圖2 流式細胞儀檢測3組SW620細胞的凋亡情況

圖3 3組SW620細胞的凋亡情況比較與對照組比較，aP<0.05

2.2抵擋丸加味雞血藤對PI3K/Akt信號通路的影響 與對照組比較，抵擋丸加味雞血藤組和LY294002組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Ak比值顯著降低(P<0.05)，但抵擋丸加味雞血藤組與LY294002組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4、5。

圖4 3組SW620細胞PI3K/Akt信號通路免疫蛋白印跡圖

2.3抵擋丸加味雞血藤對SW620細胞侵襲/遷移相關蛋白表達的影響 與對照組比較，抵擋丸加味雞血藤組和LY294002組N-cadherin表達水平顯著降低，E-cadherin表達水平顯著升高(P<0.05)。抵擋丸加味雞血藤組與LY294002組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖6、7。與對照組比較，抵擋丸加味雞血藤組與LY29400組N-cadherin熒光顯著降低，E-cadherin熒光顯著升高(P<0.05)；但抵擋丸加味雞血藤組與LY294002組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖8、9。

圖5 抵擋丸加味雞血藤抑制PI3K/Akt信號通路的影響與對照組比較，aP<0.05

圖6 3組SW620細胞N-cadherin和E-cadherin免疫蛋白印跡圖

圖7 3組SW620細胞N-cadherin和E-cadherin表達比較與對照組比較，aP<0.05

圖8 3組SW620細胞N-cadherin和E-cadherin免疫熒光染色結果(×20)藍色熒光標記為細胞核；綠色熒光標記為N-cadherin/E-cadherin

圖9 3組SW620細胞N-cadherin和E-cadherin相對熒光強度比較與對照組比較，aP<0.05

2.4抵擋丸加味雞血藤對SW620荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用 SW620荷瘤小鼠經抵擋丸加味雞血藤和PI3K抑制劑LY294002治療后，腫瘤生長速度明顯降低。實驗終點時，與對照組比較，抵擋丸加味雞血藤組和LY294002組小鼠腫瘤體積顯著性縮小(P<0.05);但抵擋丸加味雞血藤組與LY294002組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖10。隨后，取材經TUNEL染色檢測腫瘤內細胞凋亡情況，實驗結果顯示，與對照組比較，抵擋丸加味雞血藤組和LY294002組腫瘤內凋亡細胞數量顯著性升高(P<0.05)，但抵擋丸加味雞血藤組與LY294002組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖11、12。

圖10 3組SW620荷瘤小鼠腫瘤體積比較與對照組比較，aP<0.05

圖11 3組SW620荷瘤小鼠腫瘤TUNEL染色結果比較(標尺長度50 μm)

圖12 3組SW620荷瘤小鼠腫瘤LUNEL涂色后細胞凋亡比較與對照組比較，aP<0.05

3 討論

據統計2018年全球CRC有超過180萬新診斷病例和88.1萬死亡病例，約占全部癌癥病例和死亡人數的1/10，而肝轉移是導致CRC患者死亡的最主要因素[1,7-8]。PI3K/AKT信號通路是腫瘤中激活最頻繁的信號通路之一，該信號通路活化是癌癥的標志[9-11]。人類細胞中有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三類PI3K表達，Ⅰ類PI3K的脂質產物可激活下游激酶AKT(AKT1、AKT2、AKT3)。實體癌癥中常見PI3K信號通路的激活突變，該突變率在晚期乳腺癌、胃癌和CRC等不同腫瘤類型中增加了30%～60%[12-13]。已有研究表明，PI3K/Akt信號通路異常激活與上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)密切相關。EMT是腫瘤最常見的侵襲和轉移起始原因[14-16]。E-cadherin、N-cadherin是與EMT密切相關的鈣黏蛋白。在肺癌中WSTF可激活PI3K/Akt信號通路，下調E-cadherin，上調N-cadherin的表達，腫瘤細胞呈現典型的EMT形態學變化[17]。CRC中也發現類似的結果，Gli1通過PI3K-Akt信號通路激活EMT，促進CRC細胞轉移[18]。因此，抑制PI3K/Akt信號通路的異常激活或可抑制腫瘤的增殖和遷移。

濕熱邪毒是腫瘤發生、發展的重要原因之一。《醫宗金鑒》云“癰疽原是火毒生，經絡阻塞氣血凝”，因邪熱侵襲、導致氣滯血瘀、腫塊形成。CRC的發生也正是由于機體正氣不足，脾失健運，氣機不暢，邪毒侵入，濕熱蘊結，局部氣血運行不暢，濕毒瘀凝下注于腸，滯留積聚所致。其證候特征為局部腫塊，或腫瘤破潰，灼熱疼痛，膿血腥臭，發熱，心煩，口渴，尿赤便秘，舌紅苔黃、脈數。“祛瘀通絡，活血攻毒”法是指由“抵擋丸”出自《傷寒論》：水蛭9 g，虻蟲9 g，桃仁6 g，大黃15 g加味雞血藤9 g治之。水蛭，功效破血，逐瘀；虻蟲，逐瘀消癥；桃仁，活血祛瘀；大黃，涼血解毒，瀉熱逐瘀；雞血藤，功效補血、活血、通絡。本實驗體外研究結果表明，抵擋丸加味雞血藤可通過抑制PI3K/Akt信號通路，抑制腫瘤細胞增殖和促進細胞凋亡，同時上調E-cadherin，下調N-cadherin的表達，抑制腫瘤細胞EMT形態學轉變。本實驗體內研究結果進一步證明，抵擋丸加味雞血藤可顯著抑制CRC荷瘤小鼠腫瘤細胞的增殖，促進腫瘤組織內細胞的凋亡。

綜上所述，在CRC細胞系SW620中，抵擋丸加味雞血藤具有顯著的抗腫瘤效果，其通過抑制PI3K/Akt信號通路的異常激活，抑制腫瘤的增殖，并促進細胞的凋亡。調節EMT相關蛋白E-cadherin/N-cadherin表達，抑制腫瘤的EMT進程，發揮抗腫瘤效果。本研究通過“祛瘀通絡，活血攻毒”法的干預，揭示了CRC發病和肝轉移機制；為CRC治療提供了新的分子靶點，深化中醫藥預防和治療CRC發病及肝轉移的機制，為臨床治療該病提供了新藥和指導法則。