CXCR4靶向PI3K-Akt信號通路抑制小細胞肺癌血管生成

劉麗麗，呂立麗，谷 雪

小細胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)是起源于支氣管黏膜或腺體的一種高度惡性的疾病，占肺癌病例的10%～15%[1]；該病有進展迅速和廣泛轉移的特征。雖然多達80%的SCLC患者對一線化療有反應，但大多數最終會復發，預后很差。SCLC患者的5年生存率僅為1%～2%，因此迫切需要新的療法改善患者狀況[2]。

血管生成對腫瘤的生長至關重要[3]，血管內皮生長因子(vascular endothelial groxth factor, VEGF是腫瘤血管生成的關鍵因素[4]。多項SCLC基因組分析數據表明，PI3K/Akt信號通路顯著改變[5-7]。最近證據顯示，PI3K/Akt可以通過不依賴HIF-1的機制上調VEGF表達[8-9]。提示PI3K/Akt是SCLC潛在的治療靶標。CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4, CXCR4)在趨化性和歸巢中起重要作用，這是癌癥轉移的關鍵步驟。多項研究證據表明CXCR4與血管生成有關[10-11]，它可誘導Akt磷酸化，導致VEGF在mRNA和蛋白水平上表達上調，促進血管生成[12]。因此，本研究擬探究在SCLC中CXCR4是否可通過PI3K/Akt通路干擾VEGF表達抑制腫瘤血管的形成，為其治療提供新策略。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取7～8周齡SPF級雌性裸鼠18只，購自維通利華(北京)實驗動物技術有限公司，環境溫度為(22±2)℃，濕度(55±15)%，明暗光照循環12 h。小鼠自由進食。

1.2材料 β-actin抗體(ab8226，Abcam)、Akt抗體(ab18785，Abcam)、p-Akt(ab38449，Abcam)、VEGF抗體(ab32152，Abcam)、PI3K抑制劑LY294002(HY-10108,MCE)；PI3K激活劑YS-49(HY-15477，MCE)；CXCR4拮抗劑AMD3100 (ab120718，Abcam)、CXCR4激動劑NUCC-390(HY-111793，MCE)、CD31抗體(ab28364，Abcam)、Matrigel(354234，BD)。

1.3方法

1.3.1人臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)復蘇與傳代培養：按照Piao等[13]的方法從臍帶靜脈分離和培養HUVEC細胞。

1.3.2免疫蛋白印跡：SCLC細胞系NCI-H446鋪于6孔板中，1×106個/孔，分別給予PI3K激活劑YS-49(30 μmmol/L)和PI3K抑制劑LY294002(30 μmmol/L)處理24 h后，經免疫蛋白印跡法檢測Akt、p-Akt和VEGF表達水平。免疫蛋白印跡檢測步驟如下：經RIPA裂解提取總蛋白，經變性處理，10%分離膠進行SDS-PAGE電泳。將目的蛋白轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h；加入一抗4℃孵育過夜，TBST清洗3次；二抗孵育1 h，TBST清洗3次；滴加顯影液，成像系統顯影，采集圖片，Image J軟件進行灰度值分析，以β-actin為內參進行灰度值比較，實驗重復3次。SCLC細胞系NCI-H446采用PI3K激活劑(YS-49)、PI3K抑制劑(LY294002)和CXCR4激動劑(NUCC-390)、CXCR4拮抗劑(AMD3100)處理24 h后，經免疫蛋白印跡法檢測各組的Akt、p-Akt和VEGF表達水平。

1.3.3小管形成實驗： 在 24 孔培養板每孔加入 Matrigel 300 μl，37℃靜置1 h后聚合成膠，將HUVEC懸液以2×105個/ml接種于鋪有Matrigel膠的24孔板中，500 μl/孔，設對照組、NUCC-390組、AMD3100組。NUCC-390組、AMD3100組分別加入含500 nmol/L的NUCC-390 和100 nmol/L的AMD3100 培養液各500 μl；對照組中加入不含藥物的培養液500 μl。置于37℃、5% CO2細胞培養箱培養24 h，光學顯微鏡下觀察內皮細胞小管的形成，每孔隨機選取5個視野，數碼相機拍照，測量形成的小管長度。

1.3.4SCLC荷瘤小鼠藥效評價：每只裸鼠背部接種2×106個NCI-H446，待腫瘤體積達50 mm3左右時，將小鼠分為對照組、NUCC-390組和AMD3100組，每周6只。NUCC-390組和AMD3100組給藥劑量為5 mg/kg， 2/d，持續5 d。腫瘤體積計算方式為：腫瘤體積=1/2×a(長徑)×b2(短徑)。

1.3.5腫瘤血管內皮細胞染色：實驗終點安樂死小鼠，剪開背部皮膚，快速剝離腫瘤組織，放入4%多聚甲醛中固定過夜；經脫水、透明和包埋后，行石蠟切片；經CD31 IHC染色標記腫瘤組織內血管內皮細胞，實驗步驟參照說明書；染色結果拍照，隨機選5個視野，通過IPP軟件計算CD31陽性面積。

2 結果

2.1激活PI3K/Akt信號通路對VEGF表達的影響 與對照組相比，YS-49組p-Akt及VEGF表達水平顯著性升高，LY294002組p-Akt及VEGF表達水平顯著性降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 PI3K/Akt信號通路對SCLC細胞系NCI-H446 VEGF表達水平的調控SCLC為小細胞肺癌，VEGF為血管內皮生長因子；與對照組比較，aP<0.05

2.2CXCR4對PI3K/Akt/VEGF信號通路的影響 與對照組比較，NUCC-390組p-Akt及VEGF表達水平顯著升高，AMD3100組p-Akt及VEGF表達水平顯著減低(P<0.05)。見圖2。

圖2 CXCR4對SCLC細胞系NCI-H446 VEGF表達水平的調控SCLC為小細胞肺癌，CXCR4為CXC趨化因子受體4，VEGF為血管內皮生長因子；與對照組比較，aP<0.05

2.3CXCR4對體外小管形成的影響 HUVEC細胞可在Matrigel上形成管狀網絡結構。與對照組比較，NUCC-390組小管長度顯著增高，AMD3100組小管長度顯著減低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3、4。

圖3 3組HUVEC細胞體外小管長度比較(標尺 100 μm)HUVEC為人臍靜脈內皮細胞

圖4 3組HUVEC細胞形成的小管長度比較HUVEC為人臍靜脈內皮細胞；與對照組比較，aP<0.05

2.4CXCR4對NCI-H446腫瘤生長的影響 與對照組比較，NUCC-390組NCI-H446荷瘤小鼠腫瘤生長速度顯著增高，AMD3100組NCI-H446荷瘤小鼠腫瘤生長速度顯著性減低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 3組NCI-H446荷瘤小鼠的腫瘤生長速度比較與對照組比較，aP<0.05

2.5CXCR4對NCI-H446荷瘤小鼠腫瘤血管的影響 與對照組比較，NUCC-390組CD31陽性區域面積顯著增高，AMD3100組CD31陽性區域面積顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖6、7。

圖6 3組NCI-H446荷瘤小鼠腫瘤血管比較(標尺50 μm)

圖7 3組NCI-H446荷瘤小鼠腫瘤血管面積比較血管面積為IPP軟件中Area值；與對照組比較，aP<0.05

3 討論

SCLC是肺部惡性腫瘤之一，可分為局限期SCLC和廣泛期SCLC。臨床確診的肺癌中有10%～15%是SCLC，70%的SCLC患者就診時病變范圍廣，2年生存率僅為3%。20年來臨床治療SCLC進展緩慢，仍在沿用傳統化療方案[14]。因此探尋潛在的新治療靶點對該疾病的治療具有重要意義。在腫瘤進展過程中，常伴隨病理性血管生成，導致腫瘤微環境中異常血管的形成。腫瘤血管紊亂、曲折、滲漏可導致腫瘤微環境組織內間質壓力升高和缺氧，從而促進腫瘤生長[15]。VEGF是VEGF家族的主要成員，是血管生成的主要驅動因素[15]。在腫瘤中VEGF可誘導新血管生成，增加血管通透性，誘導血管內皮細胞遷移和分裂，維持內皮并重新編程血管內皮細胞基因表達譜[16]。因此，在抗腫瘤治療中抗血管生成已成為越來越有吸引力的靶點。

在SCLC中PI3K/Akt信號通路顯著改變[5-6]，而且PI3K/Akt可通過不依賴HIF-1機制上調VEGF的表達，繼而促進血管的生成[8-9]。本研究結果顯示，與對照組比較，YS-49組p-Akt和VEGF表達水平顯著性升高；LY294002組p-Akt和VEGF表達水平顯著性降低，表明PI3K/Akt信號通路激活可促進VEGF表達。研究結果表明，PI3K/Akt信號通路可調控VEGF表達，參與腫瘤血管生成過程[8]。

CXCR4為C-X-C趨化因子受體家族的成員，與多種癌癥相關。多項研究表明CXCR4與血管生成有關[10-11]。一項針對骨肉瘤患者的臨床研究發現，腫瘤組織中CXCR4的表達與VEGF表達呈顯著正相關[17]。在彌漫性大B細胞淋巴瘤的臨床研究中發現，與健康人相比，患者血清中VEGF和CXCR4的表達水平顯著性升高；并且CXCR4表達與VEGF表達呈正相關，提示靶向CXCR4可能成為新的腫瘤治療策略[18]。此外在乳腺癌的研究中發現，CXCR4可誘導Akt磷酸化，激活導致PI3K/Akt信號通路，可使VEGF蛋白表達上調；相反阻斷Akt信號的激活導致VEGF蛋白水平下降[12]。因此推測，在SCLC中CXCR4可通過調節PI3K/Akt信號通路調控VEGF表達，進而抑制腫瘤血管生成和生長。

本研究結果顯示，在體外研究中NUCC-390組HUVEC小管長度顯著高于對照組，即可顯著促進HUVEC小管的形成數量；使用CXCR4拮抗劑AMD3100刺激后，AMD3100組HUVEC小管長度顯著低于對照組，即可顯著減少HUVEC小管的形成數量；提示CXCR4在體外可調控HUVEC小管的形成。在體內研究中NUCC-390組NCI-H466荷瘤小鼠，腫瘤內血管生成數量及腫瘤體積高于對照組，而AMD3100組腫瘤內血管生成數量及腫瘤體積低于對照組。提示CXCR4激動劑NUCC-390在體內可促進腫瘤及腫瘤血管生長。

綜上所述，在SCLC中CXCR4可通過調節PI3K/Akt信號通路調控VEGF表達，進而抑制腫瘤的血管生成和生長;CXCR4抑制劑是一種潛在的抗血管生成療法。