上調(diào)DUXAP10表達(dá)對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響

李 劍，張文謙，姜 力，李延國(guó)，劉宏偉

甲狀腺癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，目前在女性惡性腫瘤發(fā)病率中居于第四位;甲狀腺癌病情隱匿，早期診斷困難，影像學(xué)是篩查的主要手段，缺乏有效的血清學(xué)篩查標(biāo)志物進(jìn)行廣泛的人群篩查[1]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA參與多種生物過(guò)程，包括翻譯、轉(zhuǎn)錄及染色體修飾等，在惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中具有重要的調(diào)控功能;在甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲、增殖、凋亡及耐藥等過(guò)程中介導(dǎo)了分子生物學(xué)機(jī)制[2-3]。DUXAP10對(duì)多種惡性腫瘤的進(jìn)展具有促進(jìn)作用[4-6]，在甲狀腺乳頭狀癌中的作用目前研究并不深入。本研究對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞中DUXAP10表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，并以pcDNA-DUXAP10上調(diào)甲狀腺癌細(xì)胞中DUXAP10表達(dá)，觀察了增殖、凋亡及細(xì)胞周期變化，并初步探討其機(jī)制，為進(jìn)一步研究DUXAP10在甲狀腺癌診斷、預(yù)后分析及靶向治療提供前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株(TPC-1、BCPAP)及正常甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞株 (Nthy-ori3-1)均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，在RPMI 1640培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清)中培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境溫度37℃(95%O2、5% CO2)。pcDNA-DUXAP 10及空白對(duì)照pcDNA-NC由上海吉加基因公司設(shè)計(jì)合成。p-Akt抗體、Akt抗體、p-mTOR及mTOR抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海艾博抗貿(mào)易有限公司，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR法：對(duì)人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株及正常甲狀腺上皮細(xì)胞株進(jìn)行裂解，采用一步法qRT-PCR試劑盒進(jìn)行DUXAP10表達(dá)檢測(cè)。首先抽提RNA并對(duì)RNA液濃度、純度及完整性進(jìn)行驗(yàn)證。然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線DNA模板后進(jìn)行DUXAP10實(shí)時(shí)定量PCR，PCR反應(yīng)液配置完畢后在RT-PCR儀上擴(kuò)增。溶解曲線采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

1.2.2pcDNA-DUXAP10轉(zhuǎn)染TPC-1細(xì)胞：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以胰酶進(jìn)行消化，直至成為單細(xì)胞懸液，24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞接種后觀察融合度高于75%后,依照細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書操作步驟,進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后進(jìn)行24 h培養(yǎng)，以空白對(duì)照組(MOCK組)及陰性對(duì)照組(pcDNA-NC組)進(jìn)行對(duì)照，qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞，將細(xì)胞接種于96孔板，每孔5000個(gè)細(xì)胞，在37℃培養(yǎng)4 h后,每孔給予20 μl的 MTT液 (5 mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)，棄去上清液后加150 μl二甲基亞砜(DMSO)，分別在培養(yǎng)24、48、72 h在酶標(biāo)定量?jī)x上以570 nm波長(zhǎng)進(jìn)行光密度值測(cè)定，對(duì)重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡：首先對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行消化及收集，然后按照試劑盒說(shuō)明書要求的步驟，以預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次、重懸細(xì)胞后加Annexin V-FITC 5 μl 和PI 5μl，混勻后避光室溫反應(yīng)10 min，加400 μl 的1×Binding Buffer，混勻后上流式細(xì)胞儀，以早期/晚期凋亡細(xì)胞百分比例進(jìn)行凋亡率統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5細(xì)胞周期檢測(cè)：首先對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行消化及收集，加入預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞后進(jìn)行離心5 min(1000 r/min)，去上清后按照試劑盒操作說(shuō)明書步驟進(jìn)行固定過(guò)夜，24 h后預(yù)冷PBS洗滌并離心后去上清，加入500 μl預(yù)冷PI(50 μg/ml)，混勻后避光反應(yīng)30 min(4℃),PBS洗滌后上流式細(xì)胞儀，以3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6Western blot法：將各組細(xì)胞裂解后,按照蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行總蛋白抽提。以BCA法定量蛋白濃度，取蛋白50 μg/孔進(jìn)行上樣，以10%的SDS-PAGE進(jìn)行電泳轉(zhuǎn)移目的蛋白到PVDF膜，蛋白膜漂洗及封膜后進(jìn)行69 min室溫條件下的封閉，吸盡封閉液后加入稀釋的Ⅰ抗,繼續(xù)孵育并回收Ⅰ抗，加入Ⅱ抗,孵育后回收Ⅱ抗，ECL檢測(cè)蛋白，發(fā)光，對(duì)灰度值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1DUXAP10在甲狀腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)及轉(zhuǎn)染pcDNA-DUXAP10的轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

2.1.1DUXAP10在甲狀腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)比較：TPC-1及BCPAP細(xì)胞株中DUXAP10的表達(dá)高于Nthy-ori 3-1細(xì)胞株(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 DUXAP10在甲狀腺癌細(xì)胞株及正常甲狀腺細(xì)胞中的表達(dá)水平比較TPC-1、BCPAP為人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株，Nthy-ori3-1為正常甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞株；與Nthy-ori3-1細(xì)胞比較，aP<0.01

2.1.2甲狀腺癌細(xì)胞株TPC-1轉(zhuǎn)染pcDNA-DUXAP10的轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)比較：轉(zhuǎn)染pcDNA-DUXAP10組DUXAP10表達(dá)顯著高于MOCK組及pcDNA-NC組(P<0.01)，其中DUXAP10表達(dá)水平較上述2組提高了約5倍。見(jiàn)圖2。

圖2 甲狀腺癌細(xì)胞株TPC-1轉(zhuǎn)染pcDNA-DUXAP10的轉(zhuǎn)染率比較MOCK組為空白對(duì)照組，pcDNA-NC組為陰性對(duì)照組；與MOCK組比較，aP<0.01；與pcDNA-NC組比較，bP<0.01

2.2上調(diào)DUXAP10表達(dá)對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖的影響 與pcDNA-NC組比較，在24、48、72 h時(shí)pcDNA-DUXAP10組TPC-1細(xì)胞增殖增高(P<0.01，P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 上調(diào)DUXAP10表達(dá)對(duì)甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞增殖的影響pcDNA-NC組為陰性對(duì)照組；與pcDNA-NC組比較，aP<0.01，bP<0.05

2.3上調(diào)DUXAP10對(duì)TPC-1細(xì)胞凋亡的影響 與pcDNA-NC組比較，pcDNA-DUXAP10組TPC-1細(xì)胞凋亡率顯著減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)上調(diào)DUXAP10對(duì)甲狀腺癌TPC-1凋亡的影響pcDNA-NC組為陰性對(duì)照組；與pcDNA-NC組比較，aP<0.05

2.4上調(diào)DUXAP10對(duì)TPC-1細(xì)胞周期的影響 pcDNA-NC組與pcDNA-DUXAP10組TPC-1細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例分別為(67.69±3.72)%和(51.28±2.26)%，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。pcDNA-NC組與pcDNA-DUXAP10組TPC-1細(xì)胞中G2/M期細(xì)胞比例分別為(7.51±1.06)%和(9.87±1.03)%，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。pcDNA-NC組與pcDNA-DUXAP10組TPC-1細(xì)胞S期細(xì)胞比例分別為(32.24±1.65)%和(23.53±1.94)%，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.5上調(diào)DUXAP10表達(dá)對(duì)甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞Akt/mTOR通路的影響 與pcDNA-NC組比較，pcDNA-DUXAP10組TPC-1細(xì)胞的p-AKT/Akt比例及p-mTOR/mTOR比例均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖5。

圖5 上調(diào)DUXAP10對(duì)2組甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞Akt/mTOR通路的影響A.2組甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞Akt/mTOR通路蛋白免疫印跡圖；B.2組甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞p-Akt/Akt表達(dá)水平比較；C.2組甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞p-mTOR/mTOR表達(dá)水平比較；pcDNA-NC組為陰性對(duì)照組；與pcDNA-NC組比較，aP<0.01

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌在甲狀腺癌中最常見(jiàn)，病灶大部分體積較小，術(shù)前診斷較為困難，總體預(yù)后較好[7]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA在多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的研究已成為熱點(diǎn)，雖然缺乏編碼蛋白的能力但是具有重要的轉(zhuǎn)錄活性，并具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等功能，對(duì)惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲及增殖等行為具有調(diào)控作用。DUXAP10在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，對(duì)肺癌細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用[8]。在卵巢癌組織中DUXAP10為高表達(dá)，并與卵巢癌不良臨床病理特征具有相關(guān)性，提示預(yù)后差[5]。

本研究結(jié)果顯示，DUXAP10在甲狀腺癌細(xì)胞株TPC-1及BCPAP中表達(dá)高于正常甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞。這表明DUXAP10可能和甲狀腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，DUXAP10在膀胱癌及前列腺癌腫瘤組織中表達(dá)高于癌旁正常組織，在膀胱癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)高于正常上皮細(xì)胞，DUXAP10表達(dá)水平越高，腫瘤分期越晚，預(yù)后越差[4, 6, 9]。本研究結(jié)果進(jìn)一步顯示，上調(diào)DUXAP10表達(dá)后，甲狀腺癌細(xì)胞增殖受到促進(jìn)，凋亡受到抑制，細(xì)胞周期活躍。這表明在甲狀腺癌細(xì)胞中DUXAP10促進(jìn)了甲狀腺癌進(jìn)展，是促癌基因。一項(xiàng)關(guān)于胃癌細(xì)胞中的研究顯示，下調(diào)DUXAP10表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞停留在G1期比例升高[10]。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，DUXAP10促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展[11]。

Akt/mTOR信號(hào)通路是多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡的重要調(diào)控通路[12]。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)甲狀腺癌細(xì)胞DUXAP10表達(dá)后，p-Akt/Akt及p-mTOR/mTOR比例升高，這表明，DUXAP10可能通過(guò)調(diào)控Akt/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞增殖及凋亡。本研究結(jié)果顯示，Akt/mTOR信號(hào)通路與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展具有密切關(guān)系，并與甲狀腺癌細(xì)胞靶向藥物耐藥相關(guān)[13-14]，Akt/mTOR通路阻斷劑對(duì)甲狀腺癌可能具有治療作用[15]。在肝癌細(xì)胞中，DUXAP10通過(guò)PI3K/Akt/mTOR通路調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖及凋亡[16]。

綜上所述，DUXAP10可能通過(guò)靶向激活A(yù)kt/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞增殖，抑制凋亡，DUXAP10可能作為甲狀腺癌診斷的標(biāo)志物及治療的靶基因，但須進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討。