鐵蛋白納米載體及其在生物醫學領域的應用潛力

蘇 愷，范葶莉，宋勤葉*

(1. 河北農業大學動物醫學院 河北省獸醫生物技術創新中心，保定 071000；2. 滄州職業技術學院畜牧獸醫系，滄州 061001)

納米材料是一種人工制造或自然形成的、粒徑在1～100 nm的微型顆粒；其中，乳膠體、陶瓷顆粒、金屬顆粒、碳顆粒、聚合物及生物分子等均可作為納米材料。由于納米微粒的獨特結構狀態，使其產生了表面效應、小尺寸效應、量子尺寸效應等，故納米材料具有許多特殊功能。目前，納米材料已廣泛應用于醫學、藥學、生物檢測、光學以及國防等領域[1]。自然條件下，生物能夠合成各種各樣的納米顆粒，如外泌體、脂蛋白、鐵蛋白、小熱休克蛋白與病毒樣顆粒等，這些納米顆粒與細胞膜作用強，極易進入細胞內，易被化學和生物學修飾或改造[1-3]。將納米技術與生物醫學、藥學相結合而制成的納米制劑和納米藥物具有更好的藥代動力學、高效性、生物相容性、安全性和靶向性等優勢，在生物醫藥領域開發應用前景十分廣闊[4]。

鐵蛋白(ferritin)由法國科學家Laufberger(1937)[5]首次發現，Lawson等[6]明確了鐵蛋白的晶體結構。除酵母外，鐵蛋白廣泛存在于動物、高等植物、細菌、真菌以及古細菌中，具有儲存鐵、調節鐵離子代謝和維持機體內鐵元素平衡及保護細胞組分等功能[7]。哺乳動物的幾乎所有組織中均有鐵蛋白，尤其是在肝和脾內含量最高[7-8]。在細胞內外均存在鐵蛋白，胞內鐵蛋白主要分布于細胞質、細胞核和線粒體中，胞外鐵蛋白則主要存在于如血清、滑膜液和腦脊液等液體中[7-9]。鐵蛋白是由一定數目的亞基以對稱方式組成一個空心結構，內部為鐵和磷酸鹽分子構成的內核，具有直徑小(外徑9～32 nm)、 耐熱(85 ℃)、耐變性劑以及蛋白亞基解體(pH 2.66～3.4)后可重新恢復(pH 7.0)原結構等獨特的理化性質[10-13]。近年來，通過對鐵蛋白進行化學修飾和基因工程改造而搭建的鐵蛋白納米載體平臺，為診斷制劑、疫苗遞送和靶向治療等的研究提供了重要支撐。本文重點綜述了鐵蛋白的結構、生物學功能及其在診斷、疫苗研究和藥物遞送等方面的研究進展，以期為基于鐵蛋白納米顆粒的檢測制劑、疫苗和藥物載體的研究提供參考。

1 鐵蛋白的結構與生物學功能

根據蛋白組成和結構的不同，鐵蛋白可分為經典鐵蛋白(ferritin, Ftn)和細菌特有鐵蛋白。Ftn是鐵蛋白家族的典型成員，見于真核生物、古細菌和細菌中，是迄今發現的分布最廣泛的一種鐵蛋白[11]。細菌特有鐵蛋白主要有Bfr(bacterioferritin)、Dps(DNA binding protein from starved cells)和Encftn(encapsulin ferritin)3種；其中，Bfr存在于細菌中，結構上與Ftn相似，但有明顯差異；Dps發現于細菌和古生菌，是一種可以與DNA結合的鐵蛋白；Encftn是在細菌中發現的直徑最大的一種鐵蛋白[7, 14-15]。

1.1 經典鐵蛋白

經典鐵蛋白Ftn由24個亞基組成，外徑約為12 nm， 內徑8 nm，為一對稱型中空球狀結構，其相對分子質量為450 ～ 480 ku。Ftn的亞基為長5 nm、寬2.5 nm的圓柱形，每個亞基由5～6個α螺旋組成[16](圖1a、1b)。天然的鐵蛋白含有鐵核(主要成分是5Fe2O3·9H2O)，每個鐵蛋白的中心空腔能夠存儲大約4 500個鐵原子，不含鐵核的鐵蛋白稱為脫鐵鐵蛋白(apoferritin)[7]。

通常情況下，Ftn球狀結構的內表面富含谷氨酸和天冬氨酸等酸性殘基，其等電點為5.0～6.0，致使鐵蛋白內表面的負電荷密度很高[17]。研究表明，鐵蛋白的24個亞基組成正八面體結構，其亞基之間連接可形成一定的通道，每個Ftn分子具有8個 3倍通道和6個4倍通道，其孔徑為0.3～0.5 nm (圖1c)。在這些通道以及Ftn內部均帶負電荷，此特征使金屬離子和帶正電荷的有機小分子可以擴散到腔內[16, 18-19]。

雖然從古細菌到高等真核生物Ftn的結構具有高度保守性，但在不同生物體內或者同種生物的不同組織器官內，鐵蛋白的亞基組成及亞基數目不同。鐵蛋白亞基包括：重鏈(H-chain，21 ku)和輕鏈(L-chain，19 ku)[20]，其中H鏈和L鏈按一定比例組裝成的鐵蛋白分子為多聚物，而由相同亞基(H鏈或L鏈)組裝成的鐵蛋白分子為均聚物。在植物和細菌中，大部分的Ftn是由相同亞基自主裝而成的均聚物，少數是由不同H鏈和L鏈組成的多聚物。哺乳動物的鐵蛋白是由H鏈和L鏈共同組裝成的多聚物，且不同組織中鐵蛋白的H鏈和L鏈的比例也不盡相同，如人的心臟中鐵蛋白H鏈含量較高，人肺和馬脾中L鏈含量較高，這是由于哺乳動物不同器官和組織對鐵離子代謝功能或者鐵存儲功能的需求不同所致[8, 21]。在昆蟲體內，Ftn由兩種亞基(命名為HCH和LCH)以固定比例(H12∶L12)組裝而成，敲除其中任何一種亞基基因都會使其胚胎致死[22]。

在不同的鐵蛋白亞基中，H鏈亞基含有高度保守的“亞鐵氧化酶”氧化位點，具有結合和氧化亞鐵離子的功能[7]，并直接參與機體對氧化損傷的保護作用[23]。而鐵蛋白L鏈亞基具有電子轉移活性，可以通過鐵蛋白殼層的電子受體和供體使鐵氧化過程中釋放的電子穿過鐵蛋白籠，提高鐵的周轉速度。Ftn特有的中空結構以及靈活的離子通道，使其在不同物質的遞送方面具有廣泛的應用潛力。

1.2 細菌特有鐵蛋白

細菌鐵蛋白Bfr的結構和直徑與Ftn相似，大多數是由24個H鏈亞基組成的均聚物，少數細菌的Bfr是由H鏈和L鏈兩種亞基組成的多聚物，如銅綠假單胞菌(Pesudomonasaeruginosa)、惡臭假單胞菌(P.putida)和藍藻(cyanobacteriumSynechocystis)中的鐵蛋白[24-25]。與經典鐵蛋白Ftn不同的是，在Bfr的每兩個亞基之間有一個血紅素基團，而經典鐵蛋白Ftn的亞基之間沒有[11]。Bfr具有儲存鐵、參與保護細胞免受氧化還原應激和維持細胞穩態的功能，但其的儲鐵功能主要是通過與血紅素結合的形式而實現的[26]。

Dps是由12個相同亞基組成的外徑約9 nm、內徑4.5 nm的四面體對稱的殼狀結構。由于Dps體積小，在其中心空腔僅能夠存儲500個左右的鐵原子。除了能存儲鐵原子之外，Dps的主要功能是防止有害的芬頓反應(fenton reaction)，保護DNA免受鐵誘導的氧化損傷[27-28]。

Encftn是細菌鐵蛋白中最大的一種，直徑有24和32 nm兩種，蛋白分子呈二十面體，分別由60和180個相同的亞基組成[10, 29]。Encftn最多能夠存儲大約30 000個鐵原子[10]，這些鐵原子可能以不均勻的形式聚集成為多個直徑5～6 nm的鐵微粒(iron granules)，它們加在一起所包含的鐵原子量大約是單個Ftn的10倍[30]。但Encftn的亞基內不含有鐵氧化酶中心和鐵原子，因此，Encftn只能依靠裝載其他鐵蛋白或組裝不完整的鐵蛋白(half-ferritin)分子來實現鐵的儲存或者轉化功能[30-32]。

2 鐵蛋白的應用

2.1 在疾病診斷方面

鐵蛋白的獨特結構使其可作為納米容器裝載具有不同功能的物質，從而提高或改善生物醫學檢測技術的應用效果。鐵蛋白裝載的物質主要包括納米熒光材料、磁性納米顆粒和過渡金屬離子[33-35]，用于腫瘤靶向熒光檢測、核磁共振成像和生化檢測等方面。

2.1.1 腫瘤靶向熒光檢測 鐵蛋白的H鏈能夠與細胞表面轉鐵蛋白受體1(transferritin receptor 1，TfR1)特異性結合，而腫瘤細胞過度表達TfR1[36]，該特性使鐵蛋白在成像檢測方面具有很大的應用潛力。已有試驗表明，用異硫氰酸熒光素(FITC)或Cy5.5標記鐵蛋白H鏈制成的納米顆粒可染色腫瘤細胞，區分癌細胞與正常細胞，檢測敏感性達98%[37-38]，但鐵蛋白與不同腫瘤細胞的結合能力有差異。此外，鐵蛋白還可以延長熒光染料的體內發光時間，如裝載熒光染料吲哚箐綠(indocyanine green，ICG)的鐵蛋白H鏈納米粒(HFN-ICG)，在小鼠活體腫瘤熒光成像檢測時，ICG在體內的保留時間延長，在給藥6 h后仍可觀察到較強的熒光信號[33]。上述研究表明，基于鐵蛋白納米顆粒的熒光檢測試劑不僅可以實現靶向性和精準性診斷的目的，而且具有高敏感性及檢測長效性的特點。

2.1.2 核磁共振成像檢測 目前，氧化鐵磁性納米顆粒(magnetic nanoparticles，MNP)作為T1造影劑和T2造影劑已廣泛應用于核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)檢測中，但是需要對MNP進行復雜的修飾才能具備高效率的組織靶向性和良好的生物相容性等特點，并且MNP具有一定的細胞毒性[39-40]。而裝載MNP的磁性鐵蛋白(magnetoferritin，MFt)具有蛋白質殼層，可以避免上述缺點，在溶液中容易分散，不相互作用，生物相容性好，成像效果顯著優于造影劑，更適用于活體MRI[41-43]。Radoul等(2016)[44]將人H鏈鐵蛋白的C末端與磁小體蛋白Mms6連接后轉染小鼠膠質瘤C6細胞，發現該嵌合磁性鐵蛋白可提高核磁共振的檢測極限。可見，裝載MNP的鐵蛋白納米顆粒可以實現組織靶向性、降低細胞毒性、提高成像準確性與檢測極限的目標。

2.1.3 生化檢測 一般鐵蛋白的H鏈亞基具有鐵氧化酶中心，因此鐵蛋白本身即是一種納米酶。以鐵蛋白為基礎，通過不同方法裝載過渡金屬離子，獲得的人工納米酶可表現出不同的類酶活性[34]，具有良好的生物相容性和穩定性，同時鐵蛋白外殼能夠有效抵抗高溫、變性劑以及生物體內致酶失活的大分子物質的作用[34]。人工納米酶活性與鐵蛋白裝載金屬離子的量成正比，雙金屬納米酶的活性高于單一金屬的納米酶，這可能與兩種金屬離子(如Fe和Pt)存在協同效應有關[45-46]。目前，利用鐵蛋白合成的人工納米酶主要包括類鐵氧化酶、類過氧化酶、類氧化酶和類超氧化物歧化酶等(表1)[37，45-55]。這些人工納米酶可用于調節體內鐵的動態平衡、疾病診斷和治療，還可以用于清除細胞內活性氧和冷凍保存劑。

2.2 在納米疫苗研究方面

應用基因工程手段對鐵蛋白的不同亞基進行改造或修飾，將抗原蛋白引入鐵蛋白表面，同時不影響鐵蛋白各亞基之間的自主裝性能。該特點使鐵蛋白作為納米遞送系統在納米疫苗(nanoparticle vaccines)研發和抗原遞呈研究等方面突顯競爭潛力[3]。研究發現，幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，HP)鐵蛋白亞基與H1N1流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)的融合蛋白納米顆粒(HA-Ftn)能夠誘導小鼠和雪貂產生高于普通疫苗10倍以上的中和抗體，并且中和抗體作用范圍廣(可中和同亞型的不同毒株)[56]；HP-Ftn與EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)表面糖蛋白(gp350)的融合納米顆粒刺激小鼠和靈長類動物產生的特異性中和抗體水平比單純gp350糖蛋白誘導的抗體水平高10～100倍[57]。另外，鐵蛋白的H鏈和L鏈可分別與不同抗原基因(如不同流感病毒毒株的HA亞基和人類免疫缺陷病毒包膜蛋白Env)重組，制備含有兩種不同抗原的重組鐵蛋白納米顆粒，這些重組納米顆粒均能刺激小鼠產生針對相應病毒的中和抗體[58]，這為后期多價鐵蛋白納米疫苗的開發提供了理論依據。

近來，Powell等[59]體外表達的HP-Ftn與新冠肺炎病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) S蛋白的融合蛋白納米顆粒(S-Ftn)(圖2)誘導小鼠產生的血清中和抗體水平比20名新冠肺炎恢復期血漿捐獻者高2倍。此外，基于鐵蛋白的丙型肝炎病毒(HCV)[60]、人輪狀病毒[61]、呼吸道合胞病毒(RSV)[62]和疏螺旋體[63]等的納米顆粒，均能誘導動物產生高水平的特異性抗體(表2)。抗原蛋白在鐵蛋白亞基上的插入位點及抗原分子量的大小會影響疫苗的免疫效果，如當腸病毒71的VP1蛋白呈現在鐵蛋白外部時，誘導小鼠產生的抗體滴度較高；抗原肽分子越大，免疫效果越好；當抗原設計在鐵蛋白環區(loop zone)時，免疫效果最好，保護率最高[64]。

有關鐵蛋白納米疫苗能夠誘導高水平且持久免疫應答的機制研究發現，鐵蛋白納米疫苗顆粒可在免疫小鼠的淋巴結內沉積，刺激特異性B淋巴細胞成熟，但在免疫獼猴時卻未發現該效果，對此需要進一步深入探究[65]。Wang等[66]發現鐵蛋白-乙肝病毒(HBV)表面抗原preS1納米顆粒能同時主動靶向淋巴結中的常駐SIGNR1+巨噬細胞和SIGNR1+樹突狀細胞，分別促進B細胞和Tfh細胞的活化應答，該機制可能是誘導機體持久產生高水平抗體的主要原因，并且該研究認為鐵蛋白納米疫苗的免疫增強效果可能還與鐵蛋白能重復展示目的抗原有關。另有研究表明，鐵蛋白可通過激活TLR4/NF-κB途徑刺激骨髓樹突狀細胞成熟，進而促進T細胞增殖分化為輔助性Th1和Th2細胞，增強機體的免疫反應[67]。上述研究表明，鐵蛋白納米疫苗可以同時刺激B細胞和T細胞活化，誘導完整的免疫應答反應；鐵蛋白本身不僅可以作為非病毒型疫苗運輸載體，而且其本身還具有免疫增強效果。

表1 基于鐵蛋白的人工納米酶

表2 以鐵蛋白為抗原遞送系統的疫苗研究

2.3 在藥物遞送系統方面

2.3.1 化學藥物遞送系統 鐵蛋白作為遞送系統裝載化學藥物，可以有效避免藥物在體內被快速清除，延長藥物的半衰期，減少藥物用量，同時也可以實現靶向給藥，提高細胞攝取藥物的效果。Macone等[68]利用人H鐵蛋白特異性識別CD71的功能，將H鐵蛋白部分序列嵌合在古細菌鐵蛋白基因中，在大腸桿菌中表達出“人源化古生鐵蛋白(HumFt)”，然后裝載細胞色素C(圖3)，從而將細胞色素C成功傳遞給急性早幼粒細胞白血病(APL) NB4細胞系，誘導細胞凋亡。包封于鐵蛋白中的阿霉素(Dox)對胃癌、肝癌、乳腺癌及黑色素瘤的療效顯著提高，同時其對正常細胞的毒性降低[69-72]。鐵蛋白藥物載體在跨越血腦屏障(blood brain barrier，BBB)治療腫瘤的研究中備受關注。Fan等[73]和Liu等[74]分別證實裝載Dox和紫杉醇(PTX)的鐵蛋白對小鼠大腦原位膠質瘤有特異性殺傷功能，且對其他器官無明顯毒性。另外，根據臨床需要，通過對鐵蛋白進行修飾可獲得對某些細胞的靶向功能，如在體外試驗中發現，將腫瘤細胞的特異性單克隆抗體共價引入鐵蛋白表面制成的抗體-藥物偶聯物對黑色素瘤細胞的靶向性比無單抗引入偶聯物的靶向性高出25倍[75]；用低分子量的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)處理的鐵蛋白可以快速穿過肺支氣管黏液層，當惡性肺癌小鼠吸入PEG處理的包裹阿霉素的重鏈鐵蛋白后，成活率提高50%[76]；負載光敏劑ZnF16Pc的葉酸與鐵蛋白納米偶聯物能有效抑制小鼠體內腫瘤的生長和轉移[77]。綜上表明，鐵蛋白可以作為體內靶向治療的理想藥物載體。

2.3.2 核酸或多肽類藥物遞送系統 在腫瘤治療中，由于化學藥物缺乏特異性，不良反應大，而核酸和多肽等生物制劑因穩定性差、易被降解或變性及半衰期短等，使其難以達到理想的治療效果。為了提高生物制劑的穩定性，改善其生物學活性，Li等[78]用人H鐵蛋白和L鐵蛋白分別包封小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，制得的H-siRNA和L-siRNA可免受RNA酶的降解，在培養基中于37 ℃和4 ℃條件下能分別保存24 h和4周以上，期間未發現siRNA泄露或者降解，并能有效抑制目的基因的表達。Lee等[79]將陽離子肽(CAP)、腫瘤細胞靶向肽(CTP)、腫瘤細胞穿透肽(CPP)和酶促切割肽(ECP)融合到人H鐵蛋白的C-末端，然后包封siRNA，獲得了能與腫瘤細胞特異性結合，并能穿透細胞膜的鐵蛋白-siRNA納米粒，成功地實現了siRNA在腫瘤細胞細胞質的靶向釋放及有效沉默靶基因的目的。Su等[80]將胰高血糖素樣肽(glucagon-like peptide-1，GLP-1)與人鐵蛋白H亞基N端基因融合，用大腸桿菌表達的GLP-HFT重組蛋白，保持了天然GLP-1的降血糖功能，降糖效果可至少保持24 h；皮下注射GLP-HFT重組蛋白的半衰期約為52 h，表明該鐵蛋白作為遞送載體在II型糖尿病治療藥物研發中具有巨大潛力。這些研究說明，將鐵蛋白納米遞送系統與核酸或多肽類藥物相結合，可以彌補生物類藥物的缺陷，提高藥物療效，延長藥物半衰期，并可實現藥物靶向性治療的目的，這將是今后生物醫藥研究的重要方向之一。

2.3.3 中藥或植物提取物遞送系統 中藥在疾病防治中占有重要地位，但有些中藥因溶解度差、生物利用度低或毒副作用大，而使其的應用受到限制。研究表明，用馬脾去鐵蛋白裝載槲皮素和姜黃素納米粒，不僅可提高中藥的溶解度，而且藥物能夠靶向乳腺癌細胞，誘導癌細胞凋亡，實現低劑量的中藥取得更高療效的目標，并降低了藥物耐藥性和副作用[81]。另有研究發現，用大豆鐵蛋白H2亞基裝載花青素(cyanidin-3-O-glucoside chloride, C3G)后，C3G的熱和光穩定性提高了2倍，裝載在鐵蛋白納米籠中的C3G分子比游離C3G的轉運效率高[82]。此外，在模擬胃腸道試驗中，Ftn能減緩原花青素(PCs)的釋放速度[83]。

3 小結與展望

納米技術已廣泛應用于醫學、藥學和生物檢測等領域。鐵蛋白納米顆粒存在于幾乎所有生物體內，具有高度的穩定性、良好的生物相容性和獨特的自組裝能力；在體外鐵蛋白合成簡單，方便修飾，有利于實現多種活性物質的裝載和靶向治療。鐵蛋白作為非病毒載體，在疾病診斷、抗原和藥物遞送方面的開發應用潛力巨大，但目前有關鐵蛋白納米顆粒的開發，仍然存在一些問題亟待解決，如：1)不同鐵蛋白亞基裝載目的蛋白或肽鏈大小的極限范圍；2)鐵 蛋白納米粒基因修飾后的穩定性；3)異源鐵蛋白納米籠或其衍生物在體內的代謝途徑；4)鐵蛋白裝載藥物釋放的動力學機制；5)鐵蛋白納米籠對裝載不同生物活性物質的包封率和載藥量；6)鐵蛋白與不同腫瘤細胞結合能力差異的原因。相信隨著鐵蛋白納米技術研究的深入及上述問題的解決，鐵蛋白納米顆粒將在生物醫療領域具有更廣闊的應用前景。