凝結芽孢桿菌對肉雞生長性能、血清生化指標和脛骨強度指標的影響

吳正可，張安榮，陳志敏，常文環，劉國華，蔡輝益,2，鄭愛娟*

(1.中國農業科學院飼料研究所，農業農村部飼料生物技術重點開放實驗室，北京 100081；2.生物飼料開發國家工程研究中心，北京 100081)

益生菌是指能通過改變宿主某一部位菌群結構，調節腸道菌群平衡，發揮調節宿主黏膜與系統免疫功能，促進營養吸收，保持腸道健康，從而產生有利于宿主健康的活性微生物或組成明確的混合微生物制劑[1]。近年來，隨著動物飼料中抗生素使用的限制，益生菌替代抗生素在維護動物健康中的應用日益廣泛。凝結芽孢桿菌(BacillusCoagulans)屬革蘭陽性厚壁菌門，兼性厭氧，能在低氧的腸道環境中正常生長，且具有較好的耐酸、耐膽鹽和耐高溫的抗逆性，滿足了飼料生產過程中直接添加、高溫制粒的加工需求[2-3]。同時，凝結芽孢桿菌代謝過程中產生的乳酸脫氫酶能夠促進乳酸發酵產生L型乳酸，降低動物腸道pH[4]，抑制有害菌的生長，并能為丁酸產生菌、雙歧桿菌等有益菌的生長提供能源物質，促進腸道微生態平衡，提高腸道免疫力[5-6]。有研究表明，飼糧中添加200 mg·kg-1的凝結芽孢桿菌顯著增加了黃羽肉雞全期(1～42 d)平均日增重和血清抗氧化能力[7]；Pu等[8]研究發現，飼糧中添加凝結芽孢桿菌可以提高斷奶仔豬生產性能和腸道屏障功能完整性。凝結芽孢桿菌還可在盲腸定植，產生抗菌素、氨基酸、維生素和多種消化酶。由于具備上述優點，凝結芽孢桿菌作為飼用微生態制劑于2013年12月被農業農村部正式列入《飼料添加劑品種目錄》，成為近年來我國養殖業關注的熱點。目前，關于凝結芽孢桿菌在肉雞上的研究主要集中在其對肉雞養殖效果的影響上，對于凝結芽孢桿菌提高生產性能的益生機理及對脛骨指標影響的研究較少。基于此，本試驗通過探究肉雞飼糧中添加凝結芽孢桿菌對肉雞生產性能、血清營養物質代謝指標及脛骨發育的影響，推測凝結芽孢桿菌對肉雞可能的益生機理，為凝結芽孢桿菌在肉雞養殖中的廣泛應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究中所用的凝結芽孢桿菌制劑以粉末狀的形式添加在飼料中，其活菌數≥ 1.5×109CFU·g-1。

1.2 試驗設計

選取180只1日齡體重無差異的健康AA肉仔公雞，隨機分為3個處理，分別為基礎日糧對照組(CG)、抗生素對照組(AG)及凝結芽孢桿菌處理組(BC)，每個處理6個重復，每個重復10只雞。對照組飼喂玉米-豆粕型基礎日糧，抗生素組在基礎日糧中添加5 mg·kg-1黃霉素、20 mg·kg-1吉他霉素和75 mg·kg-1金霉素，凝結芽孢桿菌處理組在基礎飼糧中添加3.6×109CFU·kg-1凝結芽孢桿菌。基礎日糧配方參考(NY/T33—2004)《雞飼養標準》設計，日糧配方及營養成分見表1。試驗分兩個階段進行，分別為前期(1～21日齡)和后期(22～42日齡)。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.3 飼養管理

本試驗在中國農業科學院南口中試基地進行。采用全封閉式雞舍，養雞前做好雞舍消毒工作。雞舍光照、溫度、相對濕度均按照《愛拔益加AA肉雞養殖手冊》進行。免疫按常規程序進行，自由飲水、自由采食，人工光照18 h，夜間定期關燈6 h，以滿足動物福利的要求。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 生產性能 分別于肉雞1、21和42日齡，以重復為單位稱重(截料12 h、不停水)，統計飼料總采食量，計算肉雞平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.4.2 血清生化指標及鈣、磷含量 在肉雞21和42日齡時，每個重復選取體重接近平均體重的1只雞，采血10 mL，裝入一次性含促凝與分離膠的真空采血管內，37 ℃靜置1 h后，3 000 r·min-1離心10 min，收集血清。采用日立7600全自動生化儀測定血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、尿酸(UA)、血氨(BA)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量以及堿性磷酸酶(ALP)活性。采用原子吸收光譜法測定血清中鈣(Ca)含量。采用鉬酸銨-偏釩酸銨比色法測定血清中磷(P)含量。

1.4.3 脛骨強度 在肉雞21和42日齡時，每個重復選取體重接近平均體重的1只雞，剝離大腿肌肉，取左側脛骨放入樣品袋中低溫冷凍保存，待試驗結束后測定相關指標。去除掉脛骨附屬的肌肉和筋腱組織后風干，自然風干后使用CMT4504型微機控制電子式萬能試驗機對左側脛骨進行3點彎曲試驗。將脛骨曲面水平放置在支架上，測定時參數設置為跨度 40 mm，單位負荷 50 kg，位移速度 10 mm·min-1，加載至標本斷裂，記錄脛骨斷裂強度。脛骨強度以牛頓(Kg)表示。

1.4.4 脛骨灰分及鈣、磷濃度 取右側脛骨用于測定脛骨灰分及鈣、磷濃度，然后小心地把脛骨夾碎置于脂肪包中(無損失)，無水乙醇浸泡48 h，無水乙醚浸泡48 h脫脂，風干后，將脛骨無損地轉移至提前稱好重量的瓷坩堝內，在 120 ℃烘箱中放置24 h 烘干，取出冷卻后測定脛骨無脂干重。將坩堝置于電爐上碳化完全后，轉移至茂福爐中 550 ℃灰化 24 h，取出冷卻后稱量并記錄灰分重，然后測定脛骨灰分中鈣、磷含量。

1.5 試驗數據統計分析

用Excel軟件整理數據，采用SPSS 21.0軟件中的獨立樣本T檢驗進行數據分析。以P<0.05作為差異顯著的判斷標準，P<0.01作為差異極顯著的判斷標準，試驗結果均表示為“平均值±標準差(Mean±SD)”。

2 結 果

2.1 飼料中添加凝結芽孢桿菌對肉雞生長性能的影響

由表2可知，飼糧中添加凝結芽孢桿菌對肉雞前期(1～21日齡)平均體重和平均日增重無顯著影響(P>0.05)；與基礎飼糧對照組相比，凝結芽孢桿菌組和抗生素組均顯著降低了肉雞日平均采食量(P<0.05)。 試驗后期(22～42日齡)，抗生素組平均體重、平均日增重、平均日采食量均顯著高于基礎飼糧對照組和凝結芽孢桿菌處理組(P<0.05)，基礎飼糧對照組和凝結芽孢桿菌處理組之間平均體重、平均日增重及平均日采食量無顯著差異(P>0.05)；相比于基礎飼糧對照組和凝結芽孢桿菌處理組，抗生素組顯著降低了肉雞后期料重比(P<0.05)。

2.2 飼料中添加凝結芽孢桿菌對肉雞血清脂類、鈣、磷含量及堿性磷酸酶活性的影響

由表3可知，21日齡時，與對照組相比，凝結芽孢桿菌處理組和抗生素組顯著增加了肉雞血清中總膽固醇和甘油三脂的含量(P<0.05)，并顯著提高了血清堿性磷酸酶的活性(P<0.05)；飼糧中添加凝結芽孢桿菌和抗生素對肉雞血清鈣、磷含量均無顯著影響(P>0.05)。42日齡時，凝結芽孢桿菌處理組血清中甘油三酯含量顯著高于對照組(P<0.05)；抗生素處理組總膽固醇含量和甘油三酯含量均顯著低于凝結芽孢桿菌處理組(P<0.05)，但與對照組無顯著差異(P>0.05)；各處理組血清堿性磷酸酶活性和鈣、磷含量無顯著差異(P>0.05)。

2.3 飼料中添加凝結芽孢桿菌對肉雞血清蛋白及代謝指標的影響

由表4可知，21日齡時，飼糧中添加凝結芽孢桿菌增加了肉雞血清中總蛋白、白蛋白及球蛋白的含量(P<0.05)，并顯著降低了血清中尿酸和血氨的含量(P<0.05)；抗生素處理組對肉雞血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白及尿酸含量無顯著影響(P>0.05)，但降低了血清中血氨的含量(P<0.05)。42日齡時，凝結芽孢桿菌組增加了肉雞血清中總蛋白和球蛋白的含量，但差異不顯著(P>0.05)，并有提高白蛋白含量的趨勢(P=0.09)；飼糧中添加凝結芽孢桿菌降低了肉雞42日齡血清血氨含量，但效果不如抗生素組顯著(P<0.05)。

表2 飼糧中添加凝結芽孢桿菌對肉雞生長性能的影響

表3 飼糧中添加凝結芽孢桿菌對肉雞血清脂類、鈣、磷含量及堿性磷酸酶活性的影響

2.4 飼料中添加凝結芽孢桿菌對肉雞脛骨鈣、磷含量及脛骨強度的影響

由表5可知，21日齡時，凝結芽孢桿菌處理組與對照組脛骨強度無顯著差異(P>0.05)，但顯著高于抗生素組(P<0.05)；飼糧中添加凝結芽孢桿菌顯著提高了肉雞脛骨鈣含量(P<0.05)，但對脛骨灰分和磷含量無顯著影響。42日齡時，凝結芽孢桿菌處理組肉雞脛骨強度高于抗生素處理組，但差異不顯著(P>0.05)；相對于對照組和抗生素處理組，凝結芽孢桿菌處理組顯著提高了肉雞脛骨鈣含量(P<0.05)，并極顯著提高了脛骨磷含量(P<0.01)；凝結芽孢桿菌和抗生素對肉雞脛骨灰分均無顯著影響(P>0.05)。

表4 飼糧中添加凝結芽孢桿菌對肉雞血清蛋白及代謝指標的影響

表5 飼糧中添加凝結芽孢桿菌對肉雞脛骨鈣、磷含量及脛骨強度的影響

3 討 論

3.1 飼糧中添加凝結芽孢桿菌對肉雞生長性能的影響

作為一種畜禽和水產飼料中常用的微生物制劑，凝結芽孢桿菌能夠有效地改善宿主動物的生產性能，提高飼養經濟效益[5, 8-9]。本試驗表明，在不影響平均日增重的前提下，飼糧中添加凝結芽孢桿菌(3.6×109CFU·kg-1)降低了肉雞21日齡時的平均日采食量，提高了飼料轉化效率，但其對生產性能的促進作用不如抗生素組(5 mg·kg-1黃霉素、20 mg·kg-1吉他霉素和75 mg·kg-1金霉素)，這與目前凝結芽孢桿菌的報道基本一致。孫煥林等[10]研究發現，在飼糧中添加1.5%的凝結芽孢桿菌制劑，可以明顯提高黃羽肉雞的生產性能。Bami等[11]報道凝結芽孢桿菌制劑(100 mg·kg-1)提高了肉雞平均日增重、平均日采食量和飼料轉化效率，并提高了42日齡時腿肌率。Lin等[12]發現，作為一種潛在的調節肉雞腸道菌群結構的益生菌，飼糧中添加0.04%的凝結芽孢桿菌不僅提高了肉雞后期(22～42日齡)的飼料轉化效率，并且增加了肉雞十二指腸和盲腸乳酸菌的含量。凝結芽孢桿菌對動物生產性能改善的機制可能是其在腸道內的定植改善了腸道微生態系統，促進了營養物質在動物腸道內的消化和吸收[13]。在益生菌改善肉雞生產性能的實踐中，益生菌穩定到達動物腸道并定植是益生菌發揮作用的關鍵。凝結芽孢桿菌由于同時具備產芽孢和產乳酸雙重特點，能較好地耐受胃酸和膽鹽等不利條件進入腸道定植[14]。凝結芽孢桿菌產生的乳酸不僅能夠降低腸道pH，促進鈣、磷轉化及其他營養要素的消化吸收，同時，凝結芽孢桿菌產生的大量乳酸可為動物腸道內其他益生菌，如丁酸產生菌、雙歧桿菌等的增殖提供營養要素[15]；另外，凝結芽孢桿菌產生的其他氨基酸、維生素及其他未知的益生因子在促進腸道營養物質消化吸收的同時，還能促進腸道發育，尤其是由動物腸道菌群產生的短鏈脂肪酸是腸道上皮組織合成的重要能量來源[16-17]。此外，凝結芽孢桿菌在動物腸道內能分泌多種宿主本身不能提供的酶，豐富宿主體內物質代謝途徑，加快腸道營養物質，如多糖和蛋白的分解和吸收，為動物的生長發育提供有利條件[18]。

3.2 飼糧中添加凝結芽孢桿菌對肉雞血清生化指標的影響

作為小腸消化和吸收功能發生變化的標志酶之一，堿性磷酸酶在宿主體內參與多種生理生化反應，不僅能水解磷酸鹽和參與脂肪轉化吸收，還能抵御病原菌脂多糖對腸道上皮組織的破壞作用，血清堿性磷酸酶水平可在一定程度上反映動物生長速度的快慢[7, 19]。本試驗觀察到凝結芽孢桿菌和抗生素均能提高肉雞前期堿性磷酸酶活性，后期伴隨著肉雞生長發育的成熟，堿性磷酸酶活性下降至無顯著差異水平，這與楊偉平等[20]的研究結果一致。甘油三酯是脂肪酸和甘油合成的前體物質，是動物體內儲存能量的重要方式；膽固醇是動物體內腎上腺皮質激素、性激素、膽汁酸及維生素D等生理活性物質合成的重要原料，也是構成細胞膜的主要成分；血清中甘油三酯和總膽固醇水平在一定程度上反映了動物體內脂類代謝狀況[21-22]。在肉雞飼養周期內，機體處于快速生長階段，血清中甘油三酯和總膽固醇生理水平上的升高有助于提高脂質在機體內的代謝循環。本研究中,凝結芽孢桿菌和抗生素均增加了1～21日齡肉雞血清中甘油三酯和總膽固醇的含量，這與鄭愛娟和吳正可[23]報道益生菌促進肉雞脂類代謝的結果一致。

血清總蛋白由白蛋白和球蛋白組成，白蛋白由肝合成，具有黏性和膠質性，在動物體內有著運輸營養物質、維持滲透壓平衡等重要功能[7]；當肝功能受損時，血清白蛋白比例下降，其下降程度與肝損失程度呈正相關[24]。球蛋白是機體重要的免疫蛋白，是動物機體體液免疫的重要組成部分。本研究中凝結芽孢桿菌提高了肉雞前期血清白蛋白和球蛋白比例，效果優于抗生素處理組，這與前人報道凝結芽孢桿菌增加血清白蛋白和球蛋白比例的結果一致[25-26]。白蛋白含量的增加提高了營養物質在動物體內的運輸效率，這可能是飼養前期凝結芽孢桿菌桿菌處理組肉雞采食量降低而日增重不受影響的直接原因。此外，本研究還發現，凝結芽孢桿菌降低了肉雞前期血清尿素氮和血氨含量，效果與抗生素組相當，但后期凝結芽孢桿菌效果不如抗生素處理組。尿素氮和血氨是動物機體內蛋白代謝的主要產物，是衡量蛋白利用率的主要指標之一。尿素氮和血氨含量的減少說明蛋白利用率提高，有助于氮沉積，高含量的氮和氨在動物體內亦會對動物健康產生不良影響[27]。凝結芽孢桿菌通過促進脂質和蛋白在肉雞體內的代謝，提高了飼料轉化效率，同時使雞只處于健康生長的狀態。

3.3 飼糧中添加凝結芽孢桿菌對肉雞鈣、磷代謝及脛骨發育的影響

白羽肉雞具有生長速度快、胸部和腿部肌肉飽滿等特點，但過快的生長速度也給肉雞骨骼系統的發育帶來沉重負擔[28]。鈣、磷是影響肉雞骨骼發育的重要因素，本研究發現，凝結芽孢桿菌對肉雞血清中鈣、磷含量無顯著影響，但顯著提高了脛骨中鈣、磷比例，且脛骨強度要高于抗生素處理組。目前，關于凝結芽孢桿菌對肉雞鈣、磷代謝及脛骨發育的研究相對較少。肉雞生長過程中，營養物質(鈣和磷)和能量供應充足能促進骨骼系統發育[29]。并且大量試驗表明，肉雞飼糧中添加乳酸菌能夠改善腸道形態和菌群結構，促進營養物質消化吸收[29-30]。因此，在飼糧鈣、磷含量保持一致的情況下，凝結芽孢桿菌桿菌可能通過促進鈣、磷在脛骨中的沉積提高脛骨強度。Charles等[31]認為，腸道微生物菌群結構可能與動物骨骼的形成和發育有關。童小樂[32]研究了健康肉雞和脛骨發育不良肉雞腸道菌群的變化，屬水平上的分析表明，健康肉雞腸道菌群優勢菌群為乳酸菌屬和巴氏桿菌屬，脛骨發育不良肉雞腸道優勢菌群為擬桿菌屬和疣微菌屬。凝結芽孢桿菌或其他乳酸菌代謝產生的乳酸等小分子有機酸可以促進腸道對鈣、鋅等礦物元素的吸收[33-34]。李葉涵等[34]研究發現，凝結芽孢桿菌能通過調節鈣、磷代謝緩解由維生素K3缺乏引起的肉雞脛骨發育不良。維生素A、B、C、D、E和K都能參與鈣的代謝，是骨形成的必需元素，添加益生菌可促進腸道微生物對此類維生素的合成與吸收[35]。由此可知，一方面，凝結芽孢桿菌可能通過其代謝過程中產生的乳酸及維生素K類物質促進腸道對鈣、磷等礦物元素的吸收，同時，凝結芽孢桿菌的添加可能改變了肉雞腸道菌群結構，調控骨形成的過程，促進了鈣、磷在脛骨中的沉積。

3.4 抗生素和凝結芽孢桿菌對肉雞作用機制及效果的比較

本研究發現，凝結芽孢桿菌和抗生素均能在一定程度上改善肉雞生長性能，并促進營養物質在肉雞體內的代謝與周轉。但總體來看，抗生素在促進動物生長方面的效果要優于凝結芽孢桿菌，凝結芽孢桿菌的效果主要體現在肉雞生長前期，而抗生素的促生長作用貫穿肉雞整個生長周期，尤其是42日齡時抗生素組體重顯著高于對照組和凝結芽孢桿菌組，這主要是由于抗生素和凝結芽孢桿菌作用機理的不同造成的。

雖然促生長類抗生素有多達幾十年的應用史且已經被禁止添加在飼料中，但目前我們對抗生素促生長的具體機制依然不是很明確。傳統的觀點認為，促生長類抗生素的各種作用效果都是基于抗生素對腸道微生物的直接作用，但也有新的研究表明，促生長類抗生素對宿主的腸道免疫和炎癥反應具有調控作用[36]。肉雞腸道中寄居著大量微生物，抗生素的干預能夠抑制有害菌的生長及其產生的毒素和次級代謝產物，減弱二者對腸道上皮細胞的刺激從而使腸壁變薄，改善腸道形態，促進營養物質的吸收；同時，抗生素還會對腸道內的正常微生物菌群結構造成一定的破壞，減少微生物對能量和養分的利用，通過節約營養消耗從而促進動物的生長[37-38]。另外一種新穎的觀點認為，動物飼糧中的抗營養因子、致敏蛋白、重金屬、氧化脂肪以及后腸道微生物紊亂逆行帶來的細菌、毒素甚至是病毒等致病因子的普遍存在，導致小腸中的炎癥反應總處于過度狀態，這會極大影響營養物質的消化和吸收，抗生素通過抑制炎癥反應的發生和調控腸道免疫狀態，在營養層面上局部改善動物腸道形態，促進營養物質吸收利用，在代謝層面上減少炎癥反應帶來的生理消耗，減少分解代謝[39]。本試驗的研究結果顯示，尤其是后期抗生素組顯著提高了肉雞生長性能并提高了飼糧轉化率，從側面證明了抗生素通過節約營養消耗促進動物生長。

凝結芽孢桿菌的益生機理主要體現在其對腸道微生態環境的調控。在肉雞的生命早期，其腸道微生物的組成極易受到宿主和環境因素的影響[40]。凝結芽孢桿菌由于具備兼性厭氧特性，能在低氧的腸道環境中正常生長，且具有較好的耐酸、耐膽鹽和耐高溫的抗逆性等特點，能夠在肉雞早期腸道中快速定植并促進腸道菌群的成熟。凝結芽孢桿菌在肉雞腸道中的成功定植又能夠促進乳酸發酵產生L型乳酸降低動物腸道pH[4]，抑制有害菌的生長，并能為丁酸產生菌、雙歧桿菌等有益菌的生長提供能源物質，促進腸道微生態平衡，提高腸道免疫力。趙娜等[21]研究發現，在飼糧中添加凝結芽孢桿菌可降低有害菌的數量，通過改變腸道微生態體系來改善腸道消化吸收功能。而隨著肉雞日齡的增加，肉雞腸道菌群趨于平衡，凝結芽孢桿菌對生長代謝的促進作用減弱，這可能是本試驗中凝結芽孢桿菌對肉雞生長后期(22～42日齡)生產性能效果不顯著的直接原因。肉雞生長后期使用凝結芽孢桿菌雖然對生長性能無顯著作用，但顯著提高了肉雞后期脛骨中鈣和磷的含量，這對于當前肉雞在品種選育過程中，因過分注重肉雞肌肉生長速度而導致其骨骼發育相對滯后，脛骨強度降低的問題有著積極的意義。

4 結 論

肉雞飼糧中添加凝結芽孢桿菌(3.6×109CFU·kg-1) 可在不影響1～21日齡肉雞體增重的前提下，降低平均日采食量，提高飼料轉化效率，促進脂類和蛋白質在肉雞體內的代謝與周轉，降低血清尿素氮和血氨含量，并促進鈣、磷在脛骨中的沉積。凝結芽孢桿菌對22～42日齡肉雞生長性能無顯著作用，但顯著提高了42日齡肉雞脛骨鈣和磷的含量，并提高了血清中總蛋白、白蛋白和球蛋白的水平，對肉雞的健康生長有積極地意義，將會成為抗生素替代方案的必備要素。