BMP4調控睪丸支持細胞增殖的初步研究

黃思藝，喬 蕾，何莉娜，王 磊，李碧筠，陳俊材，趙中權

(西南大學動物科學技術學院，重慶 400715)

哺乳動物支持細胞的增殖在出生后可以分為兩個階段，即出生期前后和青春期前，幼年睪丸最初的增長比生物體慢，之后隨著青春期的臨近其增長速度比生物體快。睪丸在這一時期的變化包括曲細精管直徑的增大、間質空間的縮小以及曲細精管長度的增大，但這些發育變化并不一定是以相同的速度發生[1-2]，牛支持細胞數量呈線性增加，表明在牛體內不存在分離為兩個不同的出生后波的現象，這推翻了哺乳動物(實驗室小鼠和大鼠除外) 產后支持細胞增殖存在兩個階段的理論[3]。而公羊與牛相似，支持細胞的數量在出生后表現出相似的線性增長[4]。由于睪丸支持細胞在青春期前停止分裂，此后支持細胞群體變得穩定，且支持細胞只能支持有限數量的生殖細胞，故雄性哺乳動物在青春期前建立的支持細胞數量決定了最終性成熟后的睪丸大小和精子數量[5]。因此，影響支持細胞發育和增殖能力的因素也可能對成年動物睪丸功能產生重要影響。

體內多種激素會影響睪丸支持細胞的增殖。其中關于促卵泡素、甲狀腺激素和睪酮等激素可刺激睪丸支持細胞增殖的報道居多。例如，促卵泡素(follicle stimulating hormone，FSH)在精子細胞代謝和精子形成中起重要作用，被認為是睪丸支持細胞分裂的主要有絲分裂因子[6-8]；而且，外源性的FSH給藥能夠增加精子發生速率，有利于治愈男性不育癥[9]。甲狀腺激素受體在睪丸發育過程中高度表達，但在成年睪丸中不表達，它可以延長睪丸支持細胞有絲分裂時間，誘導睪丸支持細胞的早期成熟，從而改變成年動物睪丸支持細胞的總數[10-12]。睪酮是由睪丸中的間質細胞產生的，可以與雄激素受體結合，調節睪丸支持細胞的合成和分泌[13-14]。這些研究都說明，睪丸支持細胞的增殖受到了體內多種激素的調控。

骨形態發生蛋白4(bone morphogenetic protein，BMP4)是轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)家族的成員，在兩性繁殖方面起著重要的作用，其表達與卵細胞的活力和功能、精子質量和胚胎發育有關。研究表明，BMP4突變型雄性小鼠不育，存在生殖細胞退化、精子計數低、精子質量差等問題[15]。在雌性哺乳動物中，BMP4促進催乳素細胞的產生，并與Smad(Sma and Mad homologue)-雌激素受體(estrogen receptor，ER)相互作用以促進泌乳素的產生，其作用機制表現為BMP4抑制ER的轉錄活性，進而減弱SMAD信號的表達[16-17]。DNA結合抑制劑(Id)屬于堿性螺旋-環-螺旋因子的內源性負調節劑，可通過防止異二聚體與DNA結合來抑制細胞分化，促進增殖，促進胚胎干細胞的自我更新和再生[18-20]。Id家族成員的DNA結合抑制劑2(Id2)是BMP目標基因中最重要的成員，作為BMP4的下游基因參與BMP4誘導的細胞功能改變[21]。本研究著重于BMP4-Id2信號軸，探討其在睪丸支持細胞中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和細胞

試驗動物選自西南大學動物科學技術學院試驗羊場的健康大足黑山羊，4組山羊分別為0、1、2和3月齡， 每組選擇3只公山羊。所有試驗均得到西南大學動物實驗倫理委員會的批準。

山羊麻醉后，立即用消毒的外科手術設備收集睪丸組織，酒精消毒，將它們放入含有雙抗的生理鹽水中，立即送回實驗室進行細胞培養。使用十字法切開睪丸的白膜以及附睪，以暴露睪丸中間的實質組織，并將其放入新的無菌培養皿中，切成約1 mm×1 mm×1 mm 的組織塊，使其均勻。兩步酶法消化勻漿，將含有DMEM/F12的混合物通過80目和400目細胞篩過濾到燒杯中，以獲得單細胞懸液，將其以1 300 r·min-1離心5 min獲得細胞沉淀。最后，向細胞沉淀物中添加適量的胎血培養基，移液混合，添加到細胞培養瓶，在顯微鏡下觀察細胞密度。調整到燒瓶底部的約60%，并標記每個細胞培養瓶。置于37 ℃ 和5%CO2的細胞培養箱中。在2、12、18和24 h后更換培養基，以去除未附著的精原細胞、基質細胞和雜質細胞。

1.2 BMP4下游靶基因的預測

本課題組前期對大足黑山羊睪丸組織進行轉錄組測序，其結果的準確性已經過檢驗[22]。通過轉錄組分析發現，BMP4與BMPRⅠ結合，使SMAD4參與磷酸化SMAD1、SMAD5、SMAD8，并最終調控Id家族基因，從而影響DNA的復制。通過初步的試驗研究發現，山羊睪丸支持細胞中Id1和Id3基因的表達水平極低。因此，本試驗選擇Id2基因作為研究對象。

1.3 貼壁細胞總RNA提取和反轉錄

根據制造商的說明，使用RNAiso試劑(TaKaRa，中國)從細胞中提取總RNA。使用型號Nanodrop1000分光光度計(中國)測定RNA濃度和純度。研究中僅考慮吸光度比A260/A280為1.8～2.0的樣品。根據PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說明書的要求首先去除基因組DNA，之后進行反轉錄反應。

1.4 山羊睪丸支持細胞總蛋白提取和Western blotting

根據制造商的說明，使用動物總蛋白提取試劑盒(Sangon Biotech，中國)提取山羊睪丸支持細胞的總蛋白，BCA法測量蛋白水平。通過電泳、轉印、封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯影等步驟測定對應抗體的相對表達量水平。

1.5 引物設計和實時熒光定量PCR

所有基因擴增引物均使用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)設計(表1)，委托重慶擎科生物有限公司合成。TB Green?Premix Ex TaqTMII熒光定量PCR的反應體系為15 μL：TB GreenTMPremix Ex TaqTMII 7.5 μL，Forward primer 0.3 μL，Reverse primer 0.3 μL，cDNA 0.6 μL，RNase Free H2O 6.3 μL。 反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環40次；63.5 ℃檢測信號，熔解曲線根據引物不同設置為65～95 ℃每0.5 ℃讀取一次Ct 值。

表1 研究中使用的PCR引物序列

1.6 質粒構建和基因干擾片段

用于過表達的質粒載體是pReceiver-07-Expression Clone(圖1)，使用的標簽抗體是血凝素(HA)。

BMP4干擾片段：BMP4(goat)-si-1: GAGCCAUGCUAGUUUGAUAtt；BMP4(goat)-si-2：GCAGGGCUUUCAUCGUAUAtt；BMP4(goat)-si-3：GCCCGGAAGAAGAAUAAGA tt。Id2干擾片段：Id2(goat)-si-1：GCCUGCUGUACAACA-UGAAtt；Id2(goat)-si-2：GGCUUCUGAAUU-CCCUUCUtt；Id2(goat)-si-3：GCAAGAUGGAA-AUCCUGCAtt。

1.7 睪丸支持細胞免疫熒光鑒定

將單細胞懸浮液加入放有細胞爬片的12孔板中，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h后，用無菌的PBS沖洗3次。4%的多聚甲醛進行固定，0.5%Triton X-100溶液進行細胞通透，檸檬酸鈉抗原修復液修復抗原，5% 的BSA溶液封閉后，孵育一抗(Rabbit Anti-WT1，Rabbit Anti-PCNA)、二抗(山羊抗兔IgG)，再用DAPI進行核染，DAB對相關蛋白進行顯色。

1.8 統計分析

所有qPCR數據均表示為“平均值±SEM”，用2-ΔΔCT法測定基因的相對表達水平。使用SPSS 19.0軟件單因素方差One-Way ANOVA分析對多個數據進行比較，使用獨立t檢驗對兩組數據進行比較分析。每個選擇鑒定的基因均進行3個生物學重復以及3次技術重復。

2 結 果

2.1 睪丸支持細胞鑒定

WT1蛋白(wilms tumor protein-1)在睪丸支持細胞中特異性表達，而在睪丸其他細胞中不表達，因此WT1蛋白表達可作為鑒定睪丸支持細胞的標準[23]。培養細胞的DAPI核染色和WT1蛋白的AlexaFluor647紅色熒光標記顯示，幾乎100%的細胞核被染成紅色，表明大多數培養細胞是睪丸支持細胞，可用于后續試驗(圖2)。

2.2 BMP4在各年齡階段睪丸支持細胞中的表達

為篩選出睪丸支持細胞中BMP4表達最高的時期，使用qPCR來檢測BMP4在0、1、2和3月齡時期睪丸支持細胞中的表達。發現0～3月齡的睪丸支持細胞中都存在BMP4表達，并且BMP4在2月齡 組的表達量極顯著高于0、1月齡組(P<0.01，圖3)。因此，使用2月齡的睪丸支持細胞進行后續試驗。

2.3 不同濃度BMP4對睪丸支持細胞增殖的影響

細胞復蘇后接種到96孔板，按分組向不同的孔中加入不同濃度的BMP4。具體分組設置為對照組、50、100、150和200 ng·mL-1組(每組4個重復孔)。放入細胞培養箱分別培養24、48、72 h。CCK8法檢測細胞的活性，結果發現，24 h后細胞增殖無明顯變化，48、72 h后細胞隨BMP4濃度的增加其增殖活力也增加。其中200 ng·mL-1的BMP4處理組與對照組相比，其增殖能力最強(P<0.05，圖4)。

2.4 BMP4干擾效果檢測

為深入了解BMP4表達水平對睪丸支持細胞的影響，本研究用RT-PCR檢測干擾片段對BMP4表達的影響。結果表明，陰性對照(NC)對BMP4基因表達無顯著影響(P>0.05)，而3對干擾片段對BMP4基因表達均有一定的干擾作用，干擾效率分別為67.85%、73.44%和64.05%(P<0.01，圖5A)，其中，BMP4 siRNA2具有最高的干擾效率，被選作后續試驗的干擾片段。利用CCK8法檢測細胞的活性，結果表明，與NC組相比，siRNA2組的細胞活力分別在24和48 h后下降了21%和34%(P<0.05)， 并在72 h后恢復，NC和siRNA組之間無顯著差異(P>0.05，圖5B)。在睪丸支持細胞中，BMP4干擾后，試驗組中PCNA的表達極顯著降低(P<0.01，圖5C)，表明BMP4干擾后細胞的增殖能力受到限制。測量細胞增殖指數表明，與NC組相比，BMP4干擾組的增殖水平顯著降低(P<0.05， 圖5D)，進一步說明BMP4干擾后細胞的增殖能力受到限制。

2.5 BMP4敲低/過表達對Id2的影響

為驗證BMP4對Id2的作用，本研究敲低了BMP4或使其過表達。敲低BMP4后，試驗組其下游靶基因Id2的mRNA水平較NC組降低，但無顯著差異(P>0.05，圖6A)，因此沒有對其進行后續試驗。BMP4過表達后，試驗組BMP4的表達水平極顯著高于NC組和對照組(P<0.01,圖6B)。使用HA標簽確定了BMP4過表達后Id2的蛋白水平，并使用qPCR檢測了Id2的mRNA表達。結果顯示，BMP4過表達后，不僅其自身表達增加，而且其靶基因Id2也顯著增加，并且過表達組中Id2的表達比NC組高1.25倍，差異有統計學意義(P<0.01，圖6C、D、E)。這些結果表明，BMP4對Id2有正向的調節作用。

2.6 干擾Id2對睪丸支持細胞增殖的影響

為篩選出對Id2干擾效果最佳的siRNA，將3個 干擾片段分別轉染睪丸支持細胞。轉染24 h后，Id2-siRNA2的干擾效率最高，為77.72%(P<0.01，圖7A)。因此，選擇Id2-siRNA2進行后續研究。為驗證Id2干擾對睪丸支持細胞增殖基因表達的影響，首先過表達BMP4，然后將Id2干擾片段轉染24 h，最后提取總RNA，利用細胞免疫熒光檢測PCNA的表達。對熒光定量結果分析表明，單獨過表達BMP4后，PCNA的表達較對照組極顯著增加(P<0.01)。BMP4過表達再轉染Id2干擾片段后，PCNA的表達與對照組差異無統計學意義(P>0.05)， 單獨干擾Id2組PCNA的表達水平與對照組相比差異顯著(P<0.05，圖7B、C)。

3 討 論

BMP4對兩性的生殖功能都有重要影響，其表達會影響精子的健康、卵細胞的活力和功能以及正常的胚胎發育[24]。本試驗首先篩選出了BMP4在大足黑山羊睪丸支持細胞中作用的最佳年齡。BMP4的表達在2月齡組最高，這可能與大足黑山羊的生殖發育階段有關，2月齡正處于青春期前期，睪丸的發育處于旺盛階段，睪丸體積增大，支持細胞也處于大幅度增長狀態[25]。基于這種推測，本研究探討了BMP4濃度對睪丸支持細胞生長活力的影響，發現睪丸支持細胞的增殖能力隨著BMP4濃度的增加而增加，這種狀態與細胞接觸異質后的生長趨勢相一致。同樣，Hai等[26]發現，BMP4能使人睪丸支持細胞的生長呈劑量依賴性。隨后，為驗證此結果，本研究構建了3條siRNA干擾片段，經過熒光檢測證實，siRNA能夠被有效地轉入到睪丸支持細胞內，且siRNA2干擾效率最高，可以作為BMP4的干擾靶點。

Id的生理功能主要是抑制細胞分化和促進細胞增殖。Yang等[27]表明，Id蛋白是人肺動脈平滑肌細胞中BMP信號轉導的關鍵下游效應子，Fei等[28]發現，在小鼠胚胎干細胞中，Id基因的啟動子區域有SMAD的結合位點，進一步表明BMP /SMAD途徑可以通過Id基因起作用。在本研究中，干擾BMP4后，睪丸支持細胞中Id2表達水平無明顯變化；而在BMP4過表達后，睪丸支持細胞中Id2的表達水平顯著上升，表明在睪丸支持細胞中BMP4能夠正向調控Id2。相對過表達BMP4再干擾Id2試驗組，干擾Id2的試驗組中PCNA基因以及蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)，這說明BMP4可以通過Id2影響支持細胞的增殖。這與Hua等[29]發現的BMP4 通過Id2蛋白促進胰腺祖細胞增殖的結果是相似的。但過表達BMP4再干擾Id2的試驗組PCNA表達水平與對照組差異不顯著，而只干擾Id2試驗組顯著低于對照組，說明BMP4可能不僅僅通過Id2這一基因對睪丸支持細胞起作用，如作為BMPs主要調控通路的SMAD通路很有可能在其中起著重要作用[30-31]。這些結果與Carlomagno等[32]對小鼠精原干細胞的發現是相似的。但是，Id2下游是否存在調控睪丸支持細胞生長的基因需要進一步研究。

4 結 論

本研究結果顯示，山羊睪丸支持細胞的增殖活力在一定范圍內與BMP4的濃度呈正相關；且BMP4能夠正向調控Id2的表達，并通過促進Id2的表達進而促進支持細胞的增殖。