雙組分系統CpxR影響禽致病性大腸桿菌的耐藥性、抗血清殺菌能力及毒力

易正飛，張耀東，王 瑤，2，朱 紅，陶程琳，3，AFAYIBO Dossêh Jean Aptre，李 濤，祁晶晶，田明星，丁 鏟，于圣青*，王少輝*

(1. 中國農業科學院上海獸醫研究所，上海 200241； 2.西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041； 3.揚州大學獸醫學院，揚州 225009)

禽致病性大腸桿菌(avian pathogenicE.coli，APEC)可感染禽類，表現多種不同癥狀的大腸桿菌病，給養禽業造成重大經濟損失。另外，APEC屬于腸道外致病性大腸桿菌(extraintestinal pathogenicE.coli, ExPEC)，與人源ExPEC中新生兒腦膜炎大腸桿菌(neonatal meningitisE.coli, NMEC)和尿道致病性大腸桿菌(uropathogenicE.coli, UPEC)的基因組結構、遺傳進化和生態分布高度相似，且具有類似的毒力因子和致病機制[1-3]。由于抗生素的不合理使用，APEC的耐藥性日趨嚴重。因此，APEC被認為是人源ExPEC毒力基因和耐藥基因的貯庫，具有重要的公共衛生意義[4]。

病原菌通過復雜的調控網絡控制基因適時表達，從而適應環境、促進生存及感染。其中，雙組分系統(two component system, TCS)廣泛存在于細菌中并參與感知響應環境變化及促進致病性。典型的TCS通常包含位于細菌膜的組氨酸激酶(histidine kinase, HK)感受元件和存在于細胞質中的應答調控(response regulator, RR)元件兩部分[5]。另外，一些TCS還含有額外的調控輔助蛋白，在蛋白磷酸化等過程發揮作用。HK感受元件能夠感應各種環境信號變化，然后通過磷酸化激活RR并調控靶基因的轉錄表達，從而改變細菌能量代謝、壓力應激等以適應環境[6-9]。CpxA/CpxR是典型的TCS，其中，組氨酸蛋白激酶CpxA作為感受元件將外界信號傳遞給CpxR發揮轉錄調控功能[10]。Cpx最早被證實主要在維持細菌膜結構蛋白的正確折疊和組裝過程中發揮作用[11]。近年來，研究發現Cpx TCS可以感知細菌膜表面壓力變化信號，調控細菌的多種毒力因子，如菌毛、分泌系統，從而有助于細菌快速適應環境，進而參與調控不同細菌的耐藥性、抵抗力和毒力[12-15]。

為了探討Cpx TCS的應答調控元件CpxR對APEC生物學特性和毒力的影響，本文構建了Cpx TCS應答調控元件編碼基因cpxR缺失株和基因互補株，比較分析了APEC菌株的生長速度、運動能力、生物被膜形成能力、藥物敏感性和抗血清殺菌能力和毒力，為深入研究APEC的致病機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒和實驗動物

O2血清型APEC菌株DE719由本實驗室分離鑒定，對雞、鴨及小鼠具有致病性[16]；大腸桿菌DH5α購自天根(北京)生化科技有限公司。Red同源重組系統質粒pKD46、pKD3、pCP20由本實驗室保存；低拷貝互補質粒pSTV28購自寶生物工程(大連)有限公司。1日齡櫻桃谷鴨購自江蘇省江陰市某養鴨合作社。

1.2 主要試劑與儀器

質粒提取試劑盒購自天根(北京)生化科技有限公司；PrimeSTAR Mix、DNA Ligation Mix、限制性核酸內切酶購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA Marker購自諾維贊生物科技有限公司；L-阿拉伯糖購自Sigma公司；DMEM培養基、胎牛血清購自Gibco公司。PCR儀購自ABI公司；電轉化儀購自Bio-Rad公司；電泳儀及凝膠成像系統購自上海天能科技有限公司。

1.3 引物設計

根據APEC DE719菌株cpxR及其上下游基因序列，設計cpxR基因缺失引物、鑒定引物及互補引物(表1)，由上海睿勉生物科技有限公司合成。

表1 本研究使用的引物

1.4 cpxR基因缺失株及互補株的構建

根據Red同源重組系統方法[17]，構建DE719菌株的cpxR基因缺失株。以pKD3質粒為模板，cpxRMu-F/R為引物，擴增cpxR基因打靶片段。將cpxR基因打靶片段電轉化入DE719-pKD46感受態細胞，過夜培養后挑取單克隆，分別以缺失鑒定引物進行PCR及測序鑒定cpxR基因缺失株。然后通過輔助性質粒pCP20去除氯霉素抗性片段，鑒定正確的cpxR基因缺失株，命名為ΔcpxR。PCR擴增cpxR基因及其啟動子序列，克隆至pSTV28構建互補質粒pSTV28-cpxR，電轉化入缺失株ΔcpxR中，獲得互補株CΔcpxR。

1.5 生長曲線與運動性測定

將新鮮菌液DE719、ΔcpxR、CΔcpxR培養至OD600 nm=1，按照1∶100的比例接種至200 mL LB培養基中，置于37 ℃，200 r·min-1條件下振蕩培養，每隔1 h取樣測定OD600 nm值，繪制生長曲線。將上述菌株培養至OD600 nm=1，取5 μL菌液點樣于0.5%瓊脂LB平板，37 ℃靜置培養12 h，測定菌圈直徑，比較不同菌株的運動能力。

1.6 生物被膜形成能力測定

將新鮮菌液稀釋至OD600 nm=0.1，每孔200 μL加入到96孔細胞板中，LB培養基作為陰性對照，37 ℃ 靜止培養24 h。棄去培養液，用無菌PBS洗3次 后加入200 μL結晶紫溶液染色30 min，再以無菌PBS洗滌5次，自然風干后加入200 μL 95%乙醇充分溶解，測定OD595 nm值。

1.7 最小抑菌濃度(MIC)測定

研究表明，Cpx TCS有助于尿道致病性大腸桿菌、沙門菌對卡那霉素和阿米卡星的耐受性[13, 15, 18-19]。因此，本研究根據CLSI-2018微量肉湯稀釋法[20]，分析APEC對卡那霉素和阿米卡星的最小抑菌濃度。將新鮮菌液1∶100倍稀釋，與不同濃度抗生素混勻，37 ℃培養16 h后判讀結果。同時設置不添加抗生素的陽性對照組和LB空白對照組。

1.8 血清殺菌試驗

以預冷PBS洗滌新鮮菌液并重懸，調整濃度為108CFU·mL-1，取10 μL菌懸液與190 μL不同濃度SPF雞血清(100%、50%、25%)混合，對照組為熱滅活SPF雞血清。37 ℃孵育30 min后倍比稀釋，涂布LB平板，統計存活細菌數。

1.9 半數致死量(LD50)測定

收集對數生長期細菌，無菌PBS洗滌2次，重懸。分別以1×107、1×106、1×105、1×104、1×103CFU·只-1劑量感染7日齡櫻桃谷鴨，每組8只， 連續觀察7 d，記錄發病及死亡情況，根據改良寇氏法計算半數致死量(LD50)。

2 結 果

2.1 cpxR 基因缺失株及互補株鑒定

分別以缺失株內側鑒定引物和外側鑒定引物對cpxR基因缺失株、互補株進行PCR檢測。如圖1所示，內側引物鑒定時，野生株和互補株可擴增出458 bp的cpxR基因目的條帶，而缺失株無cpxR基因條帶；外側引物鑒定時，野生株擴增片段大小為1 032 bp，而cpxR基因缺失株、互補株擴增片段大小為333 bp目的條帶。PCR檢測及測序結果表明，cpxR基因缺失株及互補株構建成功。

M. DNA相對分子質量標準；1、4. 野生株DE719；2、5. 缺失株ΔcpxR；3、6. 互補株CΔcpxRLane M. DNA marker; Lane 1, 4. Wild-type strain DE719; Lane 2, 5. Mutant strain ΔcpxR; Lane 3, 6. Complemented strain CΔcpxR圖1 野生株、缺失株和互補株的PCR鑒定Fig.1 Identification of wild-type, mutant and complemented strains

2.2 生長曲線與運動能力測定

生長曲線和運動能力測定結果顯示，DE719、ΔcpxR和CΔcpxR的生長速度和運動性趨于一致，無明顯差異(圖2)，表明CpxR不影響APEC的生長速度和運動能力。

A. 生長曲線；B. 不同菌株在0.5%瓊脂上的運動直徑A. Growth curves; B. Motility diameter of each strains on 0.5% LB agar圖2 APEC生長曲線和運動能力Fig.2 Growth curves and motility assays of APEC

2.3 生物被膜形成能力

生物被膜形成能力測定顯示，缺失株ΔcpxR的生物被膜形成能力略有下降，分別為野生株DE719、互補株CΔcpxR的91.5%和96.7%，但無顯著性差異(P>0.05，圖3)，表明CpxR不影響APEC的生物被膜形成能力。

2.4 藥物敏感性

微量肉湯稀釋法結果顯示DE719、ΔcpxR和CΔcpxR對卡那霉素的MIC分別為30、20、50 μg·mL-1； 對阿米卡星的最小抑菌濃度分別為40、20、70 μg·mL-1(表2)。缺失株ΔcpxR對卡那霉素和阿米卡星的敏感性均高于野生株和互補株，表明CpxR有助于降低APEC對卡那霉素和阿米卡星的敏感性。

圖3 生物被膜形成能力測定Fig.3 Determination of biofilm formation ability

表2 APEC菌株的最小抑菌濃度

2.5 抗血清殺菌能力

血清殺菌試驗結果顯示，缺失株ΔcpxR在100%、50%和25%SPF雞血清中存活率均顯著低于野生株(P<0.05)，互補株的存活率恢復至野生株水平。APEC在滅活血清中的存活率均無明顯差異(圖4)。結果表明，CpxR促進APEC的抗血清殺菌能力。

圖4 抗SPF雞血清殺菌能力Fig.4 Resistance to bactericidal activities of SPF chicken serum

2.6 半數致死量(LD50)測定

雛鴨感染試驗結果顯示，野生株DE719、缺失株ΔcpxR和互補株CΔcpxR的LD50分別為7.50×105、7.50×106、1.33×106CFU·只-1。與野生株相比，缺失株的毒力降低10倍，而互補株的致病力部分恢復。另外，作者前期研究發現，缺失株ΔcpxR感染組的雛鴨發病及死亡慢，且其臨床癥狀、病理變化及組織載菌量均低于野生株和互補株感染組雛鴨[21]，表明CpxR有助于APEC的感染及毒力。

表3 禽致病性大腸桿菌的LD50測定

3 討 論

APEC不僅給養禽業造成嚴重的經濟損失，而且作為人類ExPEC的毒力基因及耐藥基因儲庫，嚴重危害人類健康及公共衛生安全[22-23]。在感染過程中，APEC需要通過復雜的調控系統控制基因適時表達，從而抵御機體免疫和環境壓力的殺傷[13, 15]并致病。TCS廣泛存在于細菌中，其可以感應外界環境變化，如養分、滲透壓力和抗生素等，通過雙組分蛋白的磷酸化和去磷酸化調節細胞信號傳導途徑，從而調控細菌的生理代謝、壓力應激、生物被膜及致病性等方面[5, 7, 9]。研究表明，Cpx TCS可以感知細菌膜表面壓力變化信號，調控細菌的多種毒力因子適應環境變化，有利于細菌的生存[24-26]。本研究發現CpxR不影響APEC的生長速度、運動能力和生物被膜形成能力。吳同壘等[19]發現缺失cpxR基因不影響沙門菌的生長速度。另外，在缺失株ΔcpxA中，高水平的磷酸化CpxR可能抑制鞭毛和運動基因的轉錄，而cpxR基因的缺失可能導致這種抑制作用消除，因而ΔcpxR缺失株與野生株相比在運動性和生物被膜形成能力無明顯差異[27]。

沙門菌缺失cpxR基因后，對多種抗菌藥物的敏感性增加，其中，包括阿米卡星和卡那霉素[18-19]。本研究中，缺失cpxR基因導致APEC DE719菌株對阿米卡星和卡那霉素的藥物敏感性增加，表明CpxR有利于APEC的耐藥性。TCS Cpx感知抗生素壓力信號后，調控病原菌外膜孔道蛋白和外排泵的表達，增強抵御抗生素的殺傷，從而影響細菌對藥物的敏感性[28]。CpxR參與調控大腸桿菌對氨基糖苷類藥物的敏感性[12, 29]，大腸桿菌的Cpx可影響外膜蛋白OmpC、OmpF及acrD的表達[12, 30]，從而調控大腸桿菌對氨基糖苷類藥物阿米卡星和卡那霉素的敏感性。

APEC在體內定殖后，進入血液循環引發全身性感染，從而引起家禽急性死亡，因此抗血清殺菌能力在其生存及致病過程中發揮重要作用。本研究發現，CpxR有助于APEC在血清中的存活能力，與UPEC中CpxR的結果一致[15]。細菌可以利用細胞表面分子或分泌蛋白逃避補體系統的識別，從而抵抗血清的殺傷[31]，但CpxR的抗血清殺菌機制還不明確。動物試驗結果顯示，cpxR基因缺失株對雛鴨的毒力下降約10倍，與其他菌種的CpxR功能相似[32]。其中，cpxR基因缺失株的抗血清殺菌能力降低是導致毒力下降的重要原因之一。另外，CpxR作為調控因子，通過磷酸化激活后可以結合至靶序列上調控靶基因的轉錄表達，從而參與細菌能量代謝、壓力應激及毒力等。CpxR可以直接結合菌毛基因fimA啟動子和Ⅵ型分泌系統2hcp2B操縱子序，調控菌毛和Ⅵ型分泌系統2的表達，從而影響APEC的黏附、菌間競爭能力及體內定殖能力及毒力[21, 27]。

總之，本文證實TCS CpxR在APEC對阿米卡星和卡那霉素的耐藥性、抗血清殺菌能力及毒力方面發揮著重要作用，為進一步研究APEC的環境適應性及生存能力提供參考，并為篩選抗生素靶標和防控大腸桿菌病提供新的思路。

4 結 論

缺失cpxR基因不影響禽致病性大腸桿菌(APEC)的生物被膜形成能力，但可導致APEC對阿米卡星和卡那霉素耐藥性降低；CpxR有助于APEC的抗血清殺菌能力；CpxR缺失顯著降低APEC的毒力。研究表明，Cpx雙組分系統中的CpxR在APEC耐藥性、抗血清殺菌能力及毒力方面發揮作用。