microRNA-146a通過靶向MAPK4和Myosin Va基因調控羊駝黑色素細胞增殖、遷移

劉學賢，杜 斌，郭 湘，薛驥軒，于雷濤，范瑞文

(山西農業大學動物醫學學院，太谷 030801)

microRNA (miRNAs)是一種非編碼小RNA分子，對動植物的發育生理等相關基因的表達有調節作用[1-2]。miRNAs在哺乳動物如小鼠、山羊和綿羊以及羊駝皮膚中具有多種調控作用，可以通過調節色素顆粒的合成參與毛發顏色的調控[3-6]。先前的研究表明，miR-146a靶向酪氨酸相關蛋白1(tyrosinase related protein 1，TYRP1)抑制小鼠黑素細胞黑色素的生成[7]。有研究表明，miR-146a對小鼠自身免疫、骨髓增生和癌癥具有顯著的抑制作用[8]。此外，miR-146a對胰腺癌細胞的生長和轉移有不同的影響[9]。

羊駝是重要的毛用型經濟動物，毛纖維具有22種 天然色，是研究毛色形成分子機制的理想模型。在黑色素細胞中，miRNAs的功能是多樣性的，雖然已發現miR-146a可以抑制小鼠黑色素的生成，但是否對其他生物學功能起調控作用還未見報道。本研究通過生物信息學軟件預測絲裂原活化蛋白激酶4(mitogen-activated protein kinase 4，MAPK4)和肌漿球蛋白Va (MyosinVa)也是miR-146a的靶基因，其中，MAPK4是絲裂原激活蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族的典型成員(也稱ERK4，p63MAPK)，參與了很多疾病包括腫瘤轉移等的發生過程[10-11]。MAPK信號通路涉及很多生物進程，也是影響細胞增殖的通路之一，同時也參與細胞的增殖、分化等生理過程[12]。當MAPK被激活后可相應地激活一些下游因子，如cAMP反應元件結合蛋白(cAMP-responsive-element binding protein，CREB)和絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen activated protein kinase kinase 1，MEK1)，活化的CREB可調控小眼畸形轉錄因子MITF(microphthalmia-associated transcription factor)的轉錄[13]，當MAPK信號通路被激活后，MEK1可被磷酸化，磷酸化的MEK1可調控細胞的增殖和分化[14-15]。Myosin Va屬于V類肌凝蛋白，在細胞內囊泡沿肌動蛋白絲運輸到膜對接點的過程中起重要作用[16]。在黑色素細胞的黑素體運輸和神經內分泌細胞的顆粒分泌中，MyosinVa已被證明是至關重要的[17-18]，是黑素小體轉運機制的重要組成部分[19]，且被認為是與突出結合蛋白黑色素親和素(melanophilin，MLPH)和 ras 相關蛋白結合 27a (Ras-related protein binding 27a，Rab27a)形成復合體的關鍵蛋白，在捕獲和短距離傳遞黑素體到黑色素細胞外周的過程中起重要作用[20-23]。因此，為了探求miR-146a在羊駝黑色素細胞中通過與其靶基因MAPK4和MyosinVa靶向結合后可能調控其下游基因并影響羊駝黑色素細胞的增殖和遷移的功能。本試驗通過在羊駝黑色素細胞中脂質體轉染miR-146a，從而揭示miR-146a對羊駝黑色素細胞增殖和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

羊駝黑色素細胞和293T細胞由山西農業大學羊駝生物工程實驗室提供。miR-146a mimic、inhibitor和NC (大小為20 bp的置位序列，與其他miRNA 沒有同源性)由廣州銳博生物科技有限公司合成。NheI、XbaI、XhoI(TaKaRa公司)，pmirGL0-luciferase miRNA Target Expression Vector(Promega，美國)，Dual Luciferase Reporter Assay System(Promega，美國)，膠回收試劑盒(康為世紀)，兔抗MAPK4、Myosin Va、MEK1、p-MEK1、CREB、MITF、MLPH、Rab27a多克隆抗體(北京博奧森)，抗兔、抗鼠二抗(武漢博士德), Trizol(Invitorgen，美國)，氨芐霉素、轉染試劑(Invitorgen，美國)，SYBR Prime Script TMRT PCR KIT(TaKaRa公司)，蛋白marker(Thermo，美國)，Cell Counting Kit-8(上海生工生物工程有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 pmirGL0-MAPK4-3′ UTR和pmirGL0-Myosin Va-3′ UTR雙熒光報告載體的構建 從羊駝黑色素細胞中提取總RNA，以反轉錄cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR擴增純化產物和 pmirGL0 載體分別用NheI、XbaI和NheI、XhoI于 37 ℃雙酶切3 h，產物4 ℃連接后轉化大腸桿菌 DH5α，挑取菌斑，搖菌后提取質粒測序。

1.2.2 293T和羊駝黑色素細胞的轉染 將293T細胞和羊駝黑色素細胞從液氮中取出置于37 ℃ 水浴復蘇，完全融化后放在低速離心機4 ℃離心10 min,接種于6孔板(每孔1×106個細胞),在37 ℃，5% CO2細胞培養箱中培養。細胞密度達到75%左右時，用miR-146a mimic、inhibitor和NC 轉染細胞，每組設置3個重復。

1.2.3 雙熒光素酶活性試驗檢測miR-146a與MAPK4、MyosinVa的靶向關系 終止轉染72 h 的羊駝黑色素細胞用PBS洗滌3次，按照先前檢測雙熒光素酶的步驟[6]檢測熒光素酶活性：每孔加100 μL的PLB置于混勻儀上15 min，在96孔加樣孔中每孔加入50 μL上述所得溶液，加入100 μL LAR-Ⅱ試劑讀取螢火蟲熒光素酶反應強度值，然后再加入100 μL Stop&Glo試劑，最后讀取海腎螢火蟲熒光素酶反應強度值。結果用螢火蟲螢光素酶值/海腎螢光素酶值來表示。

1.2.4 qPCR檢測相關基因的表達 轉染的細胞收樣后，Trizol法提取細胞總RNA。測定濃度后使用TaKaRa反轉錄試劑盒進行反轉錄，反應條件： 37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。通過Premier Premier 5.0軟件設計相關基因的熒光定量引物，送北京華大基因公司合成。引物序列見表1。

按照AceQ?qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒說明書進行熒光定量PCR,通過2-△△CT方法計算目的基因的相對表達量變化。

表1 引物序列及作用

1.2.5 Western blotting檢測相關基因的蛋白表達 獲取轉染細胞的總蛋白，計算上樣濃度，進行SDS-PAGE電泳。37 ℃孵育1 h(所有一抗稀釋比例均為1∶3 000)。回收一抗，室溫孵育二抗(二抗稀釋比例為1∶30 000)1 h。ECL發光試劑盒顯色后獲得圖像。

1.2.6 CCK8檢測羊駝黑色素細胞增殖能力 以每孔2 000個細胞接種在96孔細胞培養板上。待細胞貼壁后，每孔加入10 μL Cell Counting Kit-8(CCK8)試劑后，分別于0、12、24、36、48、60、72 h在酶標儀450 nm處檢測細胞增殖情況。

1.2.7 Transwell檢測羊駝黑色素細胞侵襲能力 每孔1×105個細胞種植于Transwell 24孔板小室中，設立3個重復組，培養24 h。取出小室，清除小室內側的細胞后甲醇固定30 min，結晶紫染色 30 min，自來水洗滌。顯微鏡觀察遷移細胞數，隨機挑選選5個視野計數，計算細胞平均數。

1.3 統計學方法

實時熒光定量PCR、Western blotting等結果以“平均值±標準差(Mean±SD)”表示，用GraphPad Prism 8.0軟件分析數據，采用One-Way ANOVA 進行單因素方差分析，并采取Duncan’s法進行多重比較。

2 結 果

2.1 miR-146a與MAPK4、Myosin Va靶關系的驗證

利用miRBase、Targetscan軟件進行生物信息學分析，發現MAPK4和MyosinVamRNA存在 miR-146a的潛在靶點(圖1A)。與野生型3′UTR相比，MAPK4-wt+miR-146a組雙熒光素酶活性極顯著降低36%(P<0.001)，而Myosin Va-wt+miR-146a組極顯著降低30%(P<0.001)，突變組的雙熒光素酶活性無明顯變化(圖1B、C)。

2.2 過表達miR-146a對MAPK4、Myosin Va mRNA和蛋白表達水平的影響

實時熒光定量PCR和蛋白免疫印跡法檢測過表達miR-146a的羊駝黑色素細胞中MAPK4、MyosinVa基因mRNA和蛋白的表達水平。結果顯示，轉染miR-146a mimic后，羊駝黑色素細胞中MAPK4、MyosinVa基因在轉錄水平上的表達量比NC組分別極顯著或顯著下調67% 和47%(P<0.001，P<0.01，圖2A)，蛋白質水平的表達量分別顯著或極顯著下調38%和69%(P<0.05；P<0.01，圖2B、2C)。

2.3 過表達miR-146a對相關基因mRNA和蛋白質表達水平的影響

實時熒光定量PCR和免疫印跡蛋白質檢測結果顯示，過表達miR-146a后，CREB、MITF、MLPH和Rab27a較NC組mRNA和蛋白質水平表達量均顯著降低(圖3A-C)，其中CREB蛋白質水平降低最為顯著，達70%(P<0.001)，抑制組則相反。在羊駝黑色素細胞中過表達miR-146a使CREB、MITF、MLPH和Rab27a基因在mRNA和蛋白質水平表達量均極顯著降低(P<0.01)。

2.4 miR-146a對羊駝黑色素細胞增殖能力的影響

miR-146a mimic轉染黑色素細胞后，CCK8試驗用分光光度計(450 nm)分別在0、12、24、36、48、60、72 h檢測細胞增殖，結果顯示，miR-146a轉染組的OD值在72 h前明顯低于NC組和Inhibitor組(圖4)。

2.5 miR-146a對羊駝黑色素細胞遷移能力的影響

通過Transwell 小室培養法檢測羊駝黑色素細胞遷移能力，結果顯示，miR-146a mimic轉染黑色素細胞后，穿膜細胞數以及遷移能力極顯著低于對照組(P<0.01); 而miR-146a Inhibitor轉染黑色素細胞后，穿膜細胞數以及遷移能力極顯著高于對照組(P<0.01，圖5)。

3 討 論

miRNA是重要的細胞調節因子，在細胞分化、增殖和重編程過程中都發揮至關重要的作用[24]。在黑色素細胞中，越來越多的miRNAs參與多個分子通路以調控黑色素細胞的生物學過程[25-26]。miR-146a通過抑制酪氨酸酶家族基因的表達而對小鼠黑色素細胞中黑色素的生成起調控作用[7]。在進一步挖掘miR-146a的功能時發現，MAPK4和MyosinVa是其靶基因，且有關報道顯示，miR-146a對癌細胞的增殖有影響[8-9]，因此，miR-146a可能參與羊駝黑色素細胞的增殖等生物學過程。

本研究通過雙熒光素報告基因發現，miR-146a以序列特異性的方式與MAPK4和MyosinVa的3′UTR結合，在羊駝黑色素細胞中過表達miR-146a使MAPK4、MyosinVa基因在mRNA和蛋白質水平的表達量下調，結果驗證了羊駝MAPK4和MyosinVa是miR-146a 的靶基因。

MAPK4是MAPK家族的一種絲裂原激活的蛋白激酶，MAPK信號通路參與多種生化級聯反應[12]，將信號由胞內傳遞到核內開始啟動級聯反應，從而激活相關轉錄因子，進一步調控下游MEK1、CREB、MITF等級聯反應通路上重要基因的表達[27]。本研究發現，miR-146a過表達使p-MEK1下調，而MEK1未發生變化，由此可見，MAPK4通過催化MEK1磷酸化而發生了級聯反應，通過MITF調節參與黑色素合成基因的表達[28]，而MITF在黑色素細胞和黑素瘤細胞中的發育、維持、存活、色素沉積、細胞浸潤、細胞周期以及細胞增殖中起著不可或缺的作用[29]。MITF是很多級聯反應通路重要的樞紐[30-31]，其轉錄、翻譯以及翻譯后修飾等不同水平的表達和功能調控與MEK路徑密切相關，抑制MEK可以降低MITF的轉錄[32]。MEK路徑激活后可調節人黑色素細胞CREB[33]，本研究也發現，miR-146a過表達可下調CREB的表達，CREB是MEK路徑下游的主要調控因子，可以誘導MITF的表達[34]。由此可見，miR-146a靶向調控MAPK4后通過磷酸化MEK1而調節CREB，從而抑制MITF的表達。

在黑色素細胞中產生的黑色素顆粒需運輸到樹突尖部，Myosin Va、Rab27a和MLPH三者形成的三元復合物在此過程起協同作用[35]。Rab27a是膜轉運的重要調控因子[36]，Myosin Va需要同時與黑素體上含有Rab27a和MLPH復合物的多個組分相互作用[37]。然而，還有研究表明，Myosin Va促進黑色素瘤黏附、錨定、遷移和體外侵襲，其上調可能是促進腫瘤惡性發展的機制[38]。結合本試驗對遷移試驗的結果分析，在羊駝黑色素細胞中miR-146a靶向抑制MyosinVa的同時，其復合物的其他兩個成員Rab27a和MLPH的表達也受到抑制，說明miR-146a在調控黑色素細胞遷移時，Myosin Va可能仍以復合物的形式發揮其功能。綜上所述，miR-146a對羊駝黑色素細胞增殖和遷移的調控可得出，miR-146a抑制其靶基因MAPK4和MyosinVa的表達，從而影響MAPK級聯路徑中重要因子和Myosin Va/Rab27a/MLPH復合物，進而調控羊駝黑色素細胞的增殖和遷移能力。

4 結 論

本研究結果表明，miR-146a通過靶向調控MAPK4和MyosinVa，使增殖和遷移相關基因MEK1、CREB、MITF、MLPH、Rab27a的表達下調，從而對羊駝黑色素細胞的增殖和遷移起抑制作用。