金錢白花蛇蛋白質含量測定及抗腫瘤作用初步研究

王 維 郭 欣

金錢白花蛇來源于眼鏡蛇科動物銀環蛇（Bungarus multicinctus Blyth）的幼蛇干燥體，具有祛風、通絡、止痙的功效，臨床用于治療風濕頑痹，麻木拘攣，中風口眼?斜，半身不遂，抽搐痙攣，破傷風，麻風等病癥[1]。其含有蛋白質、脂肪、氨基酸、糖類，以及鈣、磷、鐵、鋅等20 多種元素[2]。藥理研究顯示，金錢白花蛇具有良好的抗炎、鎮痛、抗腫瘤作用[3]。目前，蛋白質常用化學測定手段主要有微量凱氏定氮法[4]，雙縮脲試劑反應[5]，Folin-酚法（Lowry）[6]等。Folin-酚試劑是蛋白質含量測定最靈敏的方法之一，其原理是在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅離子結合生成復合物，Folin-酚試劑中的磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和色氨酸殘基還原，產生深藍色（鉬蘭和鎢蘭的混合物），藍色深度與蛋白的量成正相關[7]。此法操作簡單迅速不需特殊的儀器設備，且靈敏度高，15min 就有最大的顯色并可穩定數小時。因此，本研究采用Folin-酚試劑法測定金錢白花蛇粉末中蛋白質含量，以期為金錢白花蛇粉末中蛋白質提取、分離、藥理活性等方面的深入研究奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 儀器 UV-2600 紫外分光光度計（島津公司）、HWS26-電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）、電子分析天平（瑞士梅特勒）。

1.2 試劑 牛血清白蛋白（中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號20190327）、氫氧化鈉（天津市光復科技發展有限公司，批號970522）、鎢酸鈉（京華化工廠，批號970512）、鉬酸鈉（北京化學試劑公司，批號950912）、無水碳酸鈉（北京化工廠，批號20150728）、蒸餾水（MILL-Q 純水儀制備），其他試劑均為分析純，購于北京化工廠。二甲基亞砜（DMSO，購自Solarbio）。

1.3 試驗樣品 不同批次的蘄蛇樣品購買自浙江省金華市磐安藥材城。分別編號標記為樣品1（批號20190705），樣品 2（SZ -20180213），樣品 3（20190804），樣品4（20180925）。經鑒定為眼鏡蛇科動物銀環蛇（Bungarus multicinctus Blyth）的幼蛇干燥體。不同批次樣品分別粉碎成細粉，過篩，混合均勻，備用。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 配制Folin-酚試劑A 所需溶液制備 0.8%氫氧化鈉溶液制備：精密稱取氫氧化鈉0.8g 于100mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，得0.8%氫氧化鈉溶液。4%無水碳酸鈉溶液的制備：精密稱取無水碳酸鈉4.0g 于100mL 量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，得4%氫氧化鈉溶液。2%酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O）溶液的制備：精密稱取酒石酸鉀鈉2.0g 于100mL 量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，得2%酒石酸鉀鈉溶液。1%硫酸銅（CuSO4）溶液的制備：精密稱取無水硫酸銅1g 于100mL 量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，得1%硫酸銅溶液。

2.1.2 Folin-酚試劑A（1）4%無水碳酸鈉溶液25mL，0.8%氫氧化鈉溶液25mL，等體積混合。（2）2%酒石酸鉀鈉溶液0.5mL，1%硫酸銅溶液0.5mL，等體積混合。臨用時，將（1）與（2）按體積比50:1 比例混合均勻，即得。

2.1.3 Folin-酚試劑B 將鎢酸鈉（H4Na2O6W）100g，鉬酸鈉（Na2MoO4.2H2O）25g，水700mL，85%磷酸50mL，濃鹽酸100mL，置1500mL 磨口圓底燒瓶中，充分溶解，混勻，裝上磨口冷凝管，回流10h。然后，分別加入硫酸鋰150g，水50mL 及溴液數滴，開口煮15min，去除過量的溴，冷卻后稀釋至1000mL，濾過（呈微綠色）貯于棕色瓶中，臨用前用氫氧化鈉滴定液（1mol/L）滴定，酚酞作指示劑（由于試劑量微綠色，影響滴定終點觀察，可將試液稀釋100 倍再滴定），根據滴定結果，用水將試劑稀釋到相當于1mol/L 的酸度（稀釋1 倍左右）。

2.1.4 對照品溶液制備 取牛血清白蛋白對照品約21.4mg，精密稱定，置25mL 容量瓶中，加0.1mol/L 的氫氧化鈉溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.856mg/mL 牛血清白蛋白儲備液。精密吸取3mL，置于25mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.103mg/mL 對照品溶液。

2.1.5 供試品溶液的制備 稱取金錢白花蛇粉末約0.5g，置于100mL 量瓶中，加水適量使溶解，再加水定容至刻度，搖勻，精密吸取5mL，置于50mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，即得。

2.2 Folin-酚試劑法 精密吸取系列牛血清白蛋白標準溶液，供試品溶液（0.9mL）加水至1.6mL，選取純凈水（3.2mL）作為隨行空白。分別置于具塞試管中，精密加入Folin-酚試劑A 4.0mL（空白加入8.0mL），搖勻，室溫放置10min，再分別精密加入Folin-酚試劑B 0.4mL（空白加入0.8mL），搖勻，密塞，在30℃水浴中保溫30min，恢復至室溫，采用紫外分光光度計在660nm 波長下測定吸光度。

2.3 MTT 法測定肝癌細胞抑制率 肝癌SMMC7721細胞經體外培養后，以1.5×104/孔接種于96 孔板上，培養24h 到細胞貼壁后，將金錢白花蛇蛋白類提取物質稀釋至終濃度為15mg/L（低劑量組）、30mg/L（中劑量組）、45mg/L（高劑量組）培養24h，對照組給予生理鹽水30mg/L，在每個孔中加入MTT 各20μL 繼續培養4h，停止培養后將培養基除去，每孔加入DMSO150μL，混合均勻，放置室溫下10min。以酶標儀于490nm 測定光密度值（OD 值），細胞抑制率=（1-實驗組OD 值/對照組OD 值）×100%。

3 方法學驗證

3.1 線性關系 分別準確吸取2.1.4 項下牛血清白蛋白標準儲備液0.0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 和1.6mL，置于具塞試管中，各管加水至1.6mL，再分別精密加Folin-酚試劑A 4.0mL，搖勻，室溫放置10min，再分別精密加入Folin-酚試劑B 0.4mL，搖勻，密塞，在30℃水浴中保溫30min，放冷，在660nm 波長處測定吸光度，以蛋白質含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，并進行線性回歸，結果見圖1。

圖1 牛血清白蛋白標準曲線

3.2 精密度實驗 精密吸取對照品溶液2mL，重復測定吸光度6 次，RSD 為0.012%，表明儀器精密度良好。見表1。

3.3 穩定性實驗 精密吸取供試品溶液（樣品2）2mL，分別放置0、1、1.5、2、2.5、3h 測定吸光度，供試品溶液在0～3h 內穩定性良好，RSD 值為1.550%。見表2。

3.4 重復性實驗 分別稱取金錢白花蛇粉末6 份，每份各取約0.5g，置于100mL 量瓶中，加水適量使溶解，再加水定容至刻度，搖勻，精密吸取5mL，置于50mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，6 份樣品RSD 為0.709%，表明實驗重復性良好。見表3。

表1 精密度實驗結果

表2 樣品穩定性實驗結果

表3 重復性實驗結果

表4 加樣回收實驗結果

3.5 加樣回收試驗 分別稱取金錢白花蛇粉末6份，每份各約0.5g，分別向其中加入77.20mg 牛血清白蛋白對照品，置于100mL 量瓶中，加水適量使溶解，再加水定容至刻度，搖勻，精密吸取5mL，置于50mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密吸取供試品溶液0.7mL，加水至1.6mL，分別置于具塞試管中，精密加入Folin-酚試劑A 4.0mL，搖勻，室溫放置10min，再分別精密加入Folin-酚試劑B 0.4mL，搖勻，密塞，在30℃水浴中保溫30min，恢復至室溫，采用紫外分光光度計在660nm 波長下測定吸光度，計算蛋白質含量，結果顯示，蛋白質平均回收率為99.477%，RSD=0.873%。見表4。

3.6 樣品含量測定 分別準確稱量樣品各約0.5g，按照上述樣品測定方法進行制備并測定蛋白質含量。各樣品蛋白質含量由高到低依次為樣品2（173.380mg/g）、樣品4（170.810mg/g）、樣品1（153.390mg/g）、樣品3（126.470mg/g）。見表5。

3.7 對肝癌SMMU7721 細胞增殖的影響 與對照組相比較，白花蛇蛋白各個劑量組肝癌SMMU7721細胞增殖抑制率均大于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。其抑制率隨著濃度升高而逐漸增加，高劑量組抑制率達到67.821%。表明金錢白花蛇蛋白類物質對肝癌細胞有顯著抑制作用。見表6。

表5 金錢白花蛇粉末中蛋白質含量測定結果（mg/g）

表6 MTT 法檢測白花蛇蛋白對肝癌細胞增殖抑制率比較

4 討論

本研究采用Folin-酚試劑法測定金錢白花蛇粉末中蛋白質含量。已有研究利用Folin-酚試劑法測定蛋白質總量，并證實該方法可靠、準確度高，且操作簡便[8-10]。石森林和王黎霞[11]很早就采用Folin-酚試劑法測定蘄蛇中蛇毒的蛋白含量，該方法回收率能達到98.00%以上，RSD 為1.76%，且簡便、穩定、重現性好。研究顯示，蛇類所含的蛋白質成分有抑制類風濕關節炎細胞增殖和誘導凋亡作用[12]。通過調節P53 和P21 蛋白表達起到抗腫瘤作用等[13]。

本研究結果顯示，已建立的蛋白質含量測定方法具有操作簡便，靈敏度高，結果準確可靠等特點，適用于中藥金錢白花蛇中蛋白質含量的測定。金錢白花蛇作為傳統的中藥，以鮮藥組方入藥用于原發性肝癌的治療，但是其抗腫瘤機制尚不清楚。本研究結合所建立方法為金錢白花蛇蛋白質的質量控制、藥效評價、藥理活性篩查等后續深入研究奠定了基礎。同時本研究初步研究了金錢白花蛇蛋白類提取物質對肝癌SMMU7721 細胞增殖抑制的作用。結果顯示，隨著蛋白給藥劑量增加，其抑制率逐漸增強，提示金錢白花蛇蛋白類活性物質可能與其抗腫瘤存在一定的關系。