谷氨酸全營養流加發酵新工藝

劉景陽,劉云鵬,徐慶陽,2,3*

1(天津科技大學 生物工程學院,天津,300457) 2(天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室,天津,300457) 3(代謝控制發酵技術國家地方聯合工程實驗室,天津,300457)

谷氨酸是有機體內氮代謝的基礎氨基酸之一,在生命體內物質代謝方面扮演著重要的角色[1-3]。由于其獨特的生理功能,被廣泛應用于食品、醫藥、化工、化妝品和飼料行業,成為了世界上產量最大的氨基酸產品[4-5]。目前,生物素亞適量型菌株是谷氨酸發酵較為普遍使用的菌株,具有發酵周期短、產酸穩定、提取收率高和不易染菌等優點[6]。但從整個發酵周期來看,不難發現采用生物素亞適量工藝發酵時,在發酵后期菌體活力和產酸速率會有大幅度的下降,同時伴隨著泡沫的大量產生。這是由于菌體的生產能力不僅取決于菌體本身的性能,還必須給予菌體合適的環境,在發酵后期,培養基中養分不足以維持菌體正常生理代謝和合成產物的需要時,菌體活力下降,過早自溶[7],而谷氨酸菌體的衰老自溶使得菌體蛋白和膠體物質析出,加劇泡沫的產生,降低氧的傳遞效率[8-9]。隨著發酵液中溶氧的降低,谷氨酸脫氫酶的活力下降,乳酸脫氫酶活力上升,胞內氧化還原電勢升高,在其共同作用下,谷氨酸發酵的代謝流流向三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環的還原臂途徑和乳酸合成途徑,從而導致谷氨酸產量下降和雜酸產量的上升[10]。

全營養流加主要是選擇適當的全營養培養，在合適的時間內進行營養的補加,通過補加的營養來彌補菌體因生長代謝而消耗的營養物質,使其一直處于適宜的生活環境中,從而提高菌體活力、防止菌體衰老,進而使得代謝流充分地流向谷氨酸,避免雜酸的產生；采取全營養流加時,可以相應地降低初始發酵培養基濃度,解除初期培養基營養過豐富導致的營養中毒、抑制菌體生長的問題,同時防止過高的滲透壓對菌體的抑制。

本研究以生物素亞適量型菌株黃色短桿菌GDK-9為供試菌株,采用全營養流加的方式,通過對全營養流加的時間、濃度及持續流加時間進行了探究,為解決生物素亞適量型菌株發酵生產谷氨酸時由于菌體活力下降所帶來的一系列問題提出建設性意見,從而提高菌體的產酸能力,進一步提高谷氨酸產量。

1 材料與方法

1.1 菌種

L-谷氨酸生產菌：生物素亞適量型菌株黃色短桿菌GDK-9,天津科技大學代謝工程研究室保藏。

1.2 培養基

1.2.1 活化斜面培養基

葡萄糖2 g/L,蛋白胨10 g/L,牛肉膏10 g/L,酵母粉5 g/L,KH2PO4·3H2O 1 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,瓊脂粉25 g/L。

1.2.2 種子培養基

葡萄糖35 g/L,玉米漿干粉15 g/L,豆濃22 mL/L,K2HPO4·3H2O 3 g/L,MgSO4·7H2O 1 g/L,蛋氨酸0.5 g/L,蘇氨酸 1 g/L,丁二酸1 g/L,FeSO4·7H2O 5 mg/L,MnSO4·H2O 5 mg/L,微量元素[Na2Mo4·2H2O 2.5 g/L，Al(SO4)3·18H2O，2.25 g/L，NiCl2·6H2O，1.6 g/L，CaCl2·2H2O，10g/L，CuSO4·5H2O，0.4 g/L]2 mL/L,VB10.5 mg/L,VB30.5 mg/L,VB50.5 mg/L,VB120.5 mg/L,氯化膽堿0.1 g/L,甜菜堿0.1 g/L。

1.2.3 發酵培養基

MnSO4·H2O 10 mg/L,MgSO4·7H2O 1.8 g/L,FeSO4·7H2O 5 mg/L,Na2HPO4·12H2O 3.5 g/L,KCl 1.8 g/L,VB10.5 mg/L,VB30.5 mg/L,VB50.5 mg/L,VB120.5 mg/L,糖蜜1.2 g/L,玉米漿干粉2.5 g/L,豆濃15 mL/L,微量元素溶液2 mL/L,氯化膽堿0.1 g/L,甜菜堿0.1 g/L。

1.2.4 流加培養基

MnSO4·H2O 10 mg/L,MgSO4·7H2O 1.8 g/L,FeSO4·7H2O 5 mg/L,Na2HPO4·12H2O 3.5 g/L,KCl 1.8 g/L,VB10.5 mg/L,VB30.5 mg/L,VB50.5 mg/L,VB120.5 mg/L,豆濃15 mL/L,微量元素溶液2 mL/L,氯化膽堿0.1 g/L,甜菜堿0.1 g/L。

1.3 主要儀器

LDZH-100KBS型全自動立式蒸汽滅菌器,天津博鑫生物科技有限公司；5 L自動控制發酵罐,上海保興生物設備工程有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀,山東省科學院生物研究所；Agilent 1200高效液相色譜儀,Agilent Technologies；KQ-C高壓蒸汽發生器,上海奉賢協新機電廠；752分光光度計,上海分析儀器廠；OLYMPUS生物顯微鏡,日本OLYMPUS會社。

1.4 培養方法

1.4.1 菌種活化

使用接種環每次從保藏在-80 ℃的甘油管中蘸取2～3環菌液,然后均勻接種于3支一代斜面培養基上,于32 ℃培養箱中培養12 h,之后再從培養好的一代斜面培養基中取一環菌體接種于二代斜面培養基上,于32 ℃培養箱中培養12 h。

1.4.2 一級種子培養

將3支活化好的菌種斜面分別接種到3個1 L圓底燒瓶中,每個燒瓶中含有100 mL的種子培養基,然后將其放置于32 ℃,220 r/min的搖床上,培養6～8 h。

1.4.3 二級種子培養

將培養好的一級種子,通過發酵罐進樣口接種到含有種子培養基的5 L發酵罐中,通過流加氨水,pH控制在7.0附近,溫度34 ℃,溶氧維持在30%～50%。

1.4.4 發酵培養

當OD600達到15左右時,按體積分數為20%的接種量接入含有發酵培養基的5 L發酵罐中。發酵過程中通過流加氨水,將pH控制在7.0附近,通過控制轉速和通風量將溶氧穩定在30%～50%。初始發酵溫度為34 ℃,每4 h提高0.5 ℃,提至36 ℃(16 h)后至發酵結束不變,發酵時間為30～32 h。

1.5 檢測方法

1.5.1 pH的測定

采用發酵罐自帶的梅特勒pH電極進行測定,pH 6.4～8.0時采用精密pH試紙輔助測定。

1.5.2 殘糖含量檢測

每隔2 h取樣,離心取上清液,將其稀釋100倍,用生物傳感分析儀檢測殘糖含量。

1.5.3 菌體量檢測

每隔2 h取樣,分別稀釋10、20、50、100倍,用紫外可見分光光度計測量OD600,其吸光值范圍在0.2～0.8,如超過量程后需換下一個稀釋倍數。按公式(1)計算菌體生物量：

菌體生物量=OD600×稀釋倍數

(1)

1.5.4 有機酸和氨基酸的測定

使用高效液相色譜分析儀進行有機酸測定,首先,取1 mL的發酵液置于1.5 mL的離心管中,12 000 r/min離心5 min,取其上清液并進行適當倍數稀釋,然后過0.22 μm微孔濾膜,最后采用液相色譜分析儀進行含量檢測；色譜柱條件：Bio-Rad Aminex HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm,8 μm),0.04 mol/L硫酸緩沖液洗脫,柱溫32 ℃,流速0.4 mL/min,檢測波長為210 nm。

發酵液中氨基酸(副產物)含量采用氨基酸分析儀進行檢測,發酵液的預處理方式同上述有機酸測定,稀釋適當倍數后,然后過0.22 μm微孔濾膜,最后使用氨基酸分析儀進行定量檢測；色譜條件：LCAK06/Na色譜柱(4.6 mm×152 mm),體積分數50%的乙腈溶液和4.1 g/L的乙酸鈉溶液為流動相,進行同時洗脫,柱溫58 ℃,流速0.50 mL/min,檢測波長為570和440 nm。

1.5.5 蛋白質含量的測定

采用總蛋白定量測試盒進行測定[11-12]。

1.5.6 糖酸轉化率計算

按照公式(2)計算糖酸轉化率：

(2)

式中：ρ,L-谷氨酸質量濃度,g/L；V,發酵液總體積,L；m,總耗糖量,g。

1.6 數據處理

所有實驗數據取3次實驗的平均值。單因素方差分析之后 Dunnet t 檢驗來確定數據差異的顯著性(P<0.05)。

2 結果與討論

2.1 開始流加時間對L-谷氨酸生產的影響

分別從發酵開始后的0 h(延滯期)、2 h(對數生長期)、8 h(穩定期)和20 h(衰亡期)開始流加體積分數為30%的流加培養基,通過對其菌體量和L-谷氨酸產量的測定,明確不同的起始流加時間對菌體生長和L-谷氨酸產量的影響,結果如圖1、圖2所示。

圖1 開始流加時間對于GDK-9生長的影響Fig.1 Influence of the start time of feeding on the growth of GDK-9

圖2 開始流加時間對L-谷氨酸產量的影響Fig.2 Effect of the start time of feeding on the production of L-glutamic acid

由圖1可知,策略E為不流加發酵,最大菌體量為51,菌體量在20 h開始出現明顯下降。采用全營養流加策略后,策略A、B、C和D的最大菌體量分別達到了60、62.2、52.9和51.3,與策略E相比分別提高了17.6%、22.0%、3.7%和1.2%；菌體量出現明顯下降時間分別為24、24、22和20 h,分別向后推遲了4、4、2和0 h。從圖2中可以看出,策略J(不流加發酵)的L-谷氨酸產量為135 g/L,轉型時間為4 h。采用全營養流加后,策略F、G、H和I的谷氨酸產量分別為153、160、142和137 g/L,提升了13.3%、18.5%、5.2%和1.5%；轉型時間分別為2、2、4和4 h,分別提前了2、2、0和0 h。

經過分析可知,0和2 h開始流加,此時為菌體的對數生長期,及時補充菌體消耗的必須營養物質使得菌體一直處于最適生長狀態,菌體生長速度加快,菌體量大,菌體間競爭生物素,使得菌體細胞膜通透性更好,進而轉型時間提前,產酸速率提高；8和20 h開始流加,一方面因為在對數生長期沒有流加,營養物質大量消耗,菌體生長緩慢,另一方面又因為發酵培養基中生物素亞適量,兩方面的共同作用導致了單位菌體利用的生物素高于策略A和B,細胞膜通透性較差,剩余的生物素不足以支持菌體繼續增長,加上全營養培養基中不含有生物素,因此菌體量不再增長,最大菌體量相對較低、轉型慢、產酸速率低。發酵后期,流加的全營養培養基補充了菌體代謝所需的必須營養物質,進而使得菌體活力得到增強,產酸時間延長,菌體下降速率減緩。選擇合適的時間開始流加才能對菌體的增長和L-谷氨酸產量起到積極作用,因此,選擇在2 h開始流加全營養培養基。

2.2 不同體積分數流加對L-谷氨酸生產的影響。

為了探究全營養培養基的流加體積分數對菌體發酵性能的影響,分別按全營養培養基體積分數為20%、40%、60%、80%和100%配制流加液,通過發酵罐自帶的蠕動泵以0.1 r/min的流加速度進行流加,保證流加的穩定性,從而確定最佳的流加體積分數,結果如圖3和圖4所示。

圖3 不同流加濃度對于GDK-9生長的影響Fig.3 Effect of different feed concentration on the growth of GDK-9

圖4 不同流加濃度對于L-谷氨酸產量的影響Fig.4 Effect of different feed concentration on L-glutamic acid production

從圖3中可以看出,策略F為不流加發酵,最大菌體量為42,發酵結束的菌體量為32,菌體量下降幅度為10。采用全營養流加發酵時,隨著流加體積分數的增加,菌體量和菌體增長速率先升高后下降,策略A、B、C、D、E最大菌體量分別為43.1、48.7、54.1、50.5和45.7,較策略F分別增加了2.6%、16.0%、28.8%、20.2%和8.8%；發酵結束的菌體量為34、42.1、50、46和38.4,菌體量下降幅度分別為9.1、6.6、4.1、4.5和7.3,較策略F降低了9%、34%、59%、55%和27%。由圖4可知,策略L的L-谷氨酸產量為130 g/L,采用流加策略后,策略G、H、I、J、K的L-谷氨酸產量分別為136、147、163、155和140 g/L,分別提高了4.6%、13%、25.3%、19.2%和7.6%。

由上述結果可知,隨著流加體積分數的提高,菌體量和L-谷氨酸產量均出現先升高后下降的現象,這是因為隨著流加體積分數的提高,補充的營養物質逐漸能夠彌補發酵液中營養物質的消耗,從而提高菌體活力,大幅度緩解了菌體的衰亡速率。當流加的體積分數超過60%時,底物抑制現象反而使菌體內部各種酶的活力下降,從而導致菌體自身活力下降,這時,全營養流加對于菌體的活力提升反而不明顯[13-15]。綜上所述,最佳流加的體積分數為60%。

2.3 不同持續流加時間對L-谷氨酸生產的影響

從2 h開始,用發酵罐自帶的蠕動泵以0.1 r/min的恒定流速流加體積分數為60%的全營養培養基,分別采取持續流加8、16、24、30 h和不流加的策略,從而探究最佳持續流加時間。圖5和圖6為持續流加8、16、24、30 h和不流加時對發酵過程中菌體量及L-谷氨酸產量的測定結果。

如圖5所示,隨著流加時長的改變,不同策略間菌體量差異較大,策略E為不流加發酵,最大菌體量為51,發酵后期菌體量為38,較最大菌體量下降幅度為13；不同流加策略A、B、C、D的最大菌體量分別為63.2、66.8、67和67.3,較策略E分別提高了23.9%、30.9%、31.3%和31.9%；發酵后期的菌體量分別為53.5、58.5、61.5和62,下降幅度分別為9.7、8.3、5.5和5.3,較策略E分別降低了25.4%、36.2%、57.6%和59.2%。從圖6可知,隨著流加時長的增加,L-谷氨酸產量及生產速率逐漸提高,策略J(不流加發酵)的最終L-谷氨酸產量為137 g/L,策略F、G、J和I的L-谷氨酸產量分別為142、158、170、171.5 g/L,分別提高了3.6%、15.3%、24.1%和25.1%。

圖5 流加時長對于GDK-9生長的影響Fig.5 Effect of flow time on the growth of GDK-9

圖6 流加時長對于L-谷氨酸產量的影響Fig.6 Effect of feeding time on L-glutamic acid production

通過分析發現,流加8 h時,全營養流加對于菌體活力的提升僅能維持在對數增長期,對于穩定期的延長及菌體衰老死亡的緩解并不能起到作用；持續流加16 h時,穩定期出現延長,但衰亡期的OD600的下降速率與不流加發酵相比并沒有明顯下變化降；持續流加24和30 h結果差距不明顯,說明當流加超過24 h后,全營養流加對于菌體發酵性能的提升效果大幅下降,繼續流加反而導致成本的增加,因此基本確定流加24 h即可停止流加。

2.4 優化條件下的發酵驗證

依據上述實驗所得的最佳流加發酵條件為2 h開始流加,持續24 h流加體積分數為60%的全營養流加培養基,在此優化條件下進行3批次的發酵驗證,結果如圖7和圖8所示。

圖7 兩種發酵方式對于GDK-9生長的影響Fig.7 Effect of two fermentation methods on the growth of GDK-9

圖8 兩種發酵方式對于L-谷氨酸產量的影響Fig.8 Effect of two fermentation methods on L-glutamic acid production

由圖7可知,采用全營養流加策略后,2～8 h菌體增長速度加快,最大菌體量為66,相較于不流加發酵的53,提高了26.4%；菌體量出現明顯下降的時間由原來的20 h推遲到了24 h；流加發酵菌體量下降幅度為8,較不流加發酵(10)降低了20%。表明全營養流加通過補充菌體消耗的必需營養物質,起到了加快菌體生長、維持菌體活力和緩解菌體衰老死亡的積極作用。由圖8可知,不流加發酵開始產酸時間為4 h,而全營養流加發酵通過及時補加菌體生長代謝所消耗的營養物質,使得菌體活力提高,生長速度加快,菌體間競爭有限的生物素,從而使得菌體細胞膜通透性較不流加發酵更好,開始產酸時間提前到2 h,鏡檢發現此時部分菌體已經開始拉長、膨大轉變為產酸型菌株,菌體的產酸速率也比不流加發酵要高。最終,流加發酵的L-谷氨酸產量為168 g/L,相較于不流加發酵的137 g/L,提高了23.4%。

在發酵過程中,代謝副產物也是影響菌體發酵性能的一大因素[16-17],因此,本研究在優化條件下對其發酵液中的乳酸、丙氨酸及糖酸轉化率進行了測定分析,結果如圖9和表1所示。

通過對上述結果分析發現,采用全營養流加策略,一方面及時流加的全營養培養基解決了發酵過程中必需營養物質缺乏的問題,提高了菌體活力,從而提升了TCA循環的速率和通量,使得丙酮酸不會被過多積累[18-19]；另一方面,菌體活力的增加也緩解了菌體的衰老死亡,發酵后期菌體量下降幅度降低,因而產生的菌體蛋白也相對降低,經測定發酵液中的可溶性蛋白含量由18.5 g/L降低到了14.9 g/L,降低了19.4%,可溶性蛋白的減少使得泡沫不再大量產生,保證了氧氣的傳遞效率,降低了乳酸脫氫酶等酶的活力,使得丙酮酸盡可能的流向谷氨酸[20]。因此,由丙酮酸生成的副產物乳酸和丙酮酸分別由不流加發酵的3.6和2.5 g/L降低到了3.1和2.06 g/L,糖酸轉化率也從不流加發酵的61.5%提高到了流加發酵的63%。

圖9 兩種發酵方式對于可溶性蛋白、乳酸和丙氨酸含量的影響Fig.9 Effect of two fermentation methods on the content of soluble protein, lactic acid and alanine

表1 兩種發酵方式對糖酸轉化率的影響Table 1 Effect of two fermentation methods on the conversion rate of sugar and acid

3 結論

本研究通過實驗分析得出,最佳流加條件為從發酵2 h開始流加,持續24 h流加體積分數為60%的流加培養基。在最佳流加條件下進行L-谷氨酸發酵驗證,結果顯示,在全營養流加條件下,菌體生長速率及菌體量明顯提高,OD600達到了66,提升了29.4%,菌體轉型時間由4 h提前到2 h,提前2 h；由于轉型時間的提前及菌體活力的提升,穩定期時間延長了4 h,產酸量也得到了提高,L-谷氨酸產量為168 g/L,提高了約22.6%,副產物乳酸含量降低了13.8%,丙氨酸含量降低了17.6%,糖酸轉化率為63%,提高了1.5%。因此,全營養流加在提高菌體活力、加快菌體產酸、縮短發酵周期、提高L-谷氨酸產量、降低副產物含量方面有積極作用,對于谷氨酸行業實現高效發酵具有借鑒意義。