基于16S rRNA高通量測序技術(shù)的生態(tài)學實驗教學

何 磊，張乃方，程 磊，陳 欣

（浙江大學a.國家級生物實驗教學示范中心；b.生命科學學院，杭州 310058）

0 引言

土壤微生物在陸地生態(tài)系統(tǒng)有機質(zhì)的分解、物質(zhì)循環(huán)及土壤結(jié)構(gòu)的保持等方面具有其重要的作用［1-6］。溫度變化會影響土壤微生物活性，溫度升高促進了微生物呼吸等代謝過程，提高了微生物的活性；另一方面，土壤微生物活性也會對氣候變化產(chǎn)生正反饋作用［7-9］，微生物活性的提高會促進熱量的產(chǎn)生，加劇土壤溫度的升高，一些不易分解的碳在升溫的作用下成為較易分解的碳，從而促進微生物對有機碳的分解［10］。因此，了解微生物群落的多樣性對于氣候變化的響應具有十分重要的意義。

土壤微生物群落具有多樣性高且大部分不能單獨純培養(yǎng)的特點［11-12］，近年來，科研工作者越來越多地使用分子生物學方法進行微生物多樣性的研究［13-15］。微生物rRNA具有很高的保守性，能夠反映微生物之間的親緣關(guān)系；同時，也具有一定的變異性，通過核酸序列特征能夠鑒別不同的微生物種類。原核微生物的rRNA按照沉降系數(shù)可分為5S、16S和23S rRNA，由于16S rRNA的長短適中并同時含有保守區(qū)和變異區(qū)，因此是很好的生物標志物。由于傳統(tǒng)一代測序的數(shù)據(jù)通量過小，無法測出環(huán)境樣品中龐大數(shù)量的微生物，目前，與16S rRNA擴增結(jié)合的高通量測序手段成為了研究微生物多樣性的重要方法之一。

本文從微生物生態(tài)學科研中提煉出一個生態(tài)學科研訓練實驗——土壤微生物多樣性的分子生物學測定，該實驗先提取土壤中微生物的基因組DNA，利用微生物16S基因特定區(qū)域的通用引物對16S rRNA進行擴增，再對PCR產(chǎn)物進行純化和質(zhì)量測定，最后用Illumina測序儀進行高通量二代測序。該實驗用于多年的實驗教學實踐，大大激發(fā)了學生探索科學的欲望，提高學生綜合實驗能力，為學生日后進行相關(guān)科學研究夯實基礎。

1 實驗材料與儀器設備

1.1 實驗材料

MP FastDNA SPIN Kit for DNA試劑盒（MO BIO laboratories，Inc.，Carlsbad，CA，USA），Bioflux 切膠回收試劑盒（Bioer Technology Co.，Ltd，Hangzhou，CHN），15 mL離心管，2 mL離心管，槍頭，TAE電泳緩沖液，10 ×Taq 酶buffer，2.5 mmol／L dNTPs，Taq 酶。

1.2 儀器設備

天平，離心機（Eppendorf，Centrifuge 5424），PCR儀（Eppendorf，nexus SX1），移液器，電泳儀（BIORAD，Power Pac Basic），微量紫外-可見光分光光度計（Nanodrop，ND LITE Spectrophotometer，Thermo Fisher Scientific Inc.，Wilmington，DE，USA），切膠儀（上海培清，JS-BLUE 350E）。

2 實驗內(nèi)容與步驟

實驗土壤取于升溫實驗基地，實驗基地包括兩個處理，一個是對照處理；另一個是土壤升溫處理，升溫處理的樣地使用紅外線加熱器來為土壤增溫，懸掛高度約為1.5 m，對照處理樣地在同樣的位置懸掛一個假的加熱器。據(jù)溫度測定結(jié)果，空氣日均溫度增加了1.27℃，而土壤日均溫度增加了1.71℃。分別在每個處理點內(nèi)隨機選取3個采樣點，使用土壤柱狀取樣器收集0～10 cm的表層土以及10～20 cm的底層土，將土壤裝入密封袋后低溫保存待用。

2.1 穩(wěn)定同位素探針（SIP）實驗

為了研究升溫對微生物群落以及分解作用的影響，設計了一個室內(nèi)培養(yǎng)實驗。首先，將不同處理的土壤分成若干個20 g干重的小份，然后統(tǒng)一調(diào)整其濕度至60%，放入165 mL的廣口瓶中。之后，將不同處理中的其中一瓶作為對照，其余廣口瓶中加入碳十三標記的小麥（Trticum aestivum，13C含量＞97%，IsoLife BV，Wageningen，The Netherlands）植物材料并混合均勻，植物材料和土壤的質(zhì)量比為1∶150。將培養(yǎng)瓶遮光并在25℃的溫度下培養(yǎng)9個星期。培養(yǎng)實驗結(jié)束后取土壤進行DNA提取和后續(xù)13C-DNA的分離及測序。

2.2 土壤中DNA的提取與測定

（1）稱取500 mg土壤，加入MP Fast DNA SPIN Kit for DNA 試劑盒（MO BIO laboratories，Inc.，Carlsbad，CA，USA）中的Lysing Matrix E Tube，再加入978 μL Sodium Phosphate Buffer和122 μL MT Buffer，混勻40 s。

（2）設置離心機轉(zhuǎn)速為14 000 g，離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的干凈的2 mL離心管，加入250 μL PPS并用槍頭吹打均勻，用手上下?lián)u10次。

“互聯(lián)網(wǎng)+”的應用讓人們的整個生活發(fā)生了很大的改變，包括人們的出行方式，支付方式，都在逐步地走向便捷，當然也包括我們的學習方式，從以前的書籍到現(xiàn)在的電子版，從以前的當面授課到現(xiàn)在的視頻直播，都在發(fā)生著悄悄地改變，而且這種改變對我們來說是有益的，也是值得提倡的[3]。下面就介紹現(xiàn)在幾種常見的教學方法。

（3）設置離心機轉(zhuǎn)速為14 000 g，離心5 min，小心吸取上清液至干凈的15 mL離心管中，加入1 mL Binding Matrix Suspension（用之前要將其搖晃重懸），手工反轉(zhuǎn)2 min，然后將管子靜置3 min。

（4）小心去除500 μL上清液，避免碰到沉淀。將剩下的液體重懸，將其中的600 μL轉(zhuǎn)移到SPIN Filter中，以14 000 g的轉(zhuǎn)速離心1 min，將Catch Tube倒空，再將剩下的混合物加到SPIN Filter中，以同樣的轉(zhuǎn)速離心1 min。

（5）添加500 μL SEWS-M 到SPIN Filter并把其中的混合物用槍頭輕柔地重懸，以14 000 g的轉(zhuǎn)速離心1 min，倒出流過液并把SPIN Filter放回Catch Tube。以14 000 g的轉(zhuǎn)速再離心2 min，清干SPIN Filter中剩余的SEWS-M。

（6）移動SPIN Filter到新的Catch Tube上，打開蓋子，室溫風干5 min。

（7）加入40 μL無菌水輕輕重懸，用槍頭輕輕攪動或用手指輕彈。

（8）以14 000 g的轉(zhuǎn)速離心1 min，DNA被洗脫到Catch Tube中。

（9）取1.5 μL DNA 溶液用微量紫外-可見光分光光度計測定DNA的濃度與質(zhì)量，當OD260／OD280在1.7～2.0之間（純度較好的DNA 該比值在1.8附近），可以進行之后的步驟。

2.3 16S rRNA擴增與檢測

（2）PCR擴增。PCR程序為：94℃ 5 min，30個循環(huán)×（94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min），72℃ 10 min。

（3）取1 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳以驗證DNA序列是否擴增成功。稱取2 g瓊脂糖，與100 mL TAE緩沖液混合，加熱后再混入染料，使其凝固制成凝膠，之后將DNA樣品與Loading buffer以1∶5的比例混合，加入點樣孔，進行電泳。在目標區(qū)域看到明顯的條帶說明成功進行PCR擴增（見圖1）。

圖1 成功擴增DNA片段的電泳圖示例（紅色方框內(nèi)為符合目標片段長度的DNA）

2.4 Illumina MiSeq測序

使用干凈的刀片，對符合目標序列長度的PCR產(chǎn)物進行切膠分離，并且使用切膠回收試劑盒（Bioer Technology Co.，Ltd，Hangzhou，CHN）溶出DNA。經(jīng)微量紫外-可見光分光光度計驗證其濃度與純度后，將樣品混合，使用Illumina測序儀上機測序。

2.5 454焦磷酸測序

對于SIP實驗分離出的13C-DNA以及不含標記的DNA組分，使用針對16S序列V4-V8區(qū)的F515（5′-TCGTGCCAGCMGCCGCGG-3′）和 R1391（5′-AGACGGGCGGTGTGTRCA-3′）進行16S 擴增。其中F和R引物上都帶有8位堿基的barcode和測序需要的linker，每個樣品設有3個技術(shù)重復。100 μL的PCR體系包括AccuPrime Tag DNA聚合酶（Invitrogen，Carlsband，CA）3 個單位，10 × PCR buffer 10 μL，50 mmol／L MgSO410 μL，2.5 mmol／L dNTP（Invitrogen）8 μL，BSA（New England BioLabs，Ipswich，MA）0.5 μL，F(xiàn) 和R 引物各0.2 μmol／L，以及模板DNA5 ng，其余加無菌去離子水。PCR程序為：94℃ 2 min，25個循環(huán)×（94 ℃30 s，56 ℃30 s，68 ℃ 45 s），68 ℃10 min。PCR產(chǎn)物通過切膠回收和濃度純度測定之后進行454焦磷酸測序。

2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

（1）本實驗中主要利用QIIME軟件對數(shù)據(jù)進行后續(xù)處理：首先對數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制、序列拼接以及去除嵌合體，之后以97%的相似度進行OTU聚類，再將OTU信息與Greengenes rDNA數(shù)據(jù)庫進行比對，注釋各OTU的分類單元，得到OTU分布表格。

（2）利用QIIME中自帶的數(shù)據(jù)處理語句或者R軟件中vegan軟件包的程序?qū)TU分布信息進行分析，并比較不同樣品間多樣性及微生物分布的差異。QIIME 的具體使用方法見網(wǎng)址：http：／／qiime.org／tutorials／tutorial.html。

3 結(jié)果與討論

3.1 升溫對于下層土土壤微生物分類以及功能上分布的影響

根據(jù)下層土土壤微生物的16S rRNA序列測序結(jié)果表明，下層土中相對豐度較高的門有酸桿菌門（Acidobacteria），放線菌門（Actinobacteria），綠彎菌門（Chloroflexi），芽單胞菌門（Gemmatimonadetes），浮霉菌門（Planctomycetes），變形菌門（Proteobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia），升溫沒有顯著影響微生物的群落分布（圖2（a）），在較低的尺度的門、綱等尺度上，升溫也沒有對微生物群落分布造成顯著的影響（圖2（b））。測序結(jié)果的DCA分析結(jié)果表明升溫處理的樣品點并沒有與對照處理分開（圖2（d））。這些結(jié)果都說明升溫并不會影響土壤微生物群落的整體組成。

本文使用GeoChip比較升溫處理和對照之間微生物功能基因豐度的差異。共檢測了49 857個基因，其中85%屬于細菌，10%屬于真菌。與16S測序結(jié)果不同，DCA分析結(jié)果顯示，對于功能基因的分布，升溫處理樣品點和對照樣品點都是分開聚集，這說明升溫處理極大地改變了土壤微生物功能性基因的分布。升溫處理顯著改變了16%總的功能性基因的相對豐度，并改變了15.6%的細菌功能性基因的分布以及21%的真菌功能性基因的分布；同時升溫處理顯著提升了20.4%的碳循環(huán)相關(guān)功能基因的豐度。實驗結(jié)果表明，升溫處理雖然沒有顯著改變微生物群體分類方面的結(jié)構(gòu)，卻改變了微生物群體的功能結(jié)構(gòu)。這與之前類似的研究結(jié)果是一致的，環(huán)境變量會大幅度地改變微生物的功能結(jié)構(gòu)，卻沒有明顯改變微生物的分類結(jié)構(gòu)［17］。

圖2 升溫對于下層土土壤微生物分類以及功能上分布的影響。（a）相對豐度較高的門；（b）溫度對于微生物不同分類水平分布效應的P值；（c）溫度對所有基因以及細菌、真菌和碳循環(huán)功能基因效應的P值。（b）圖和（c）圖中虛線以下代表升溫效應在統(tǒng)計上顯著（P＜0.05）；（d）～（g）微生物群體的DCA 排序分析，包括：基于16S rRNA測序結(jié)果的細菌分類（d），基于GeoChip的微生物功能基因（e）、細菌基因（f）和真菌基因（g）。實心圈代表升溫處理，空心圈代表對照

3.2 升溫和對照處理下微生物群落在分類和功能上的結(jié)構(gòu)

SIP實驗分離出的13C-DNA和12C-DNA的16S序列擴增和測序結(jié)果表明，利用13C的微生物群體和不利用13C的微生物群體有很大的差異（圖3（a），（b））。SIP實驗分離出的DNA的GeoChip測定結(jié)果表明，無論是對于13C-DNA還是12C-DNA，升溫處理下的功能基因分布都與對照處理下差異很大，而可利用13C的微生物功能基因又與利用12C的微生物功能基因分布差異很大（圖3（c）～（e））。結(jié)果說明，升溫對于碳分解相關(guān)功能基因分布的影響十分顯著。

圖3 SIP實驗中升溫和對照處理下微生物群落在分類和功能上的結(jié)構(gòu)。（a）占優(yōu)勢的門的相對豐度；（b）～（e）總的微生物群體以及可利用13C的微生物群體在分類和功能上的結(jié)構(gòu)分布。其中：（b）基于16S測序的細菌群體；（c）GeoChip測的全部功能基因；（d）細菌的功能性基因；（e）真菌的功能性基因。圖中實心符號代表升溫處理，空心符號代表對照處理

4 結(jié)語

本實驗將16S rRNA高通量測序技術(shù)與同位素探針技術(shù)應用于生態(tài)學本科實驗教學中。通過本實驗，一方面學生切身體驗到如何用試劑盒進行土壤DNA的提取，瓊脂糖電泳擴增與檢測，Illumina MiSeq測序以及測序結(jié)果的分析等一系列過程，大大激發(fā)了學生探索土壤微生物多樣性奧秘的興趣；另一方面，學生學習了如何利用統(tǒng)計分析軟件對OTU分布信息進行分析，并比較不同樣品間多樣性及微生物分布的差異，開拓了學生在生態(tài)學統(tǒng)計及應用方面的思路。實踐證明，該實驗提高了學生綜合性實驗能力，包括實驗操作、數(shù)據(jù)分析處理、結(jié)果探索以及多種實驗手段的融合，為學生的進一步科學研究奠定了基礎。