膜聯蛋白Ⅴ微泡體外高特異性靶向識別凋亡細胞

李夢琴，朱 梅，馮煜然，范 旭

(昆明醫科大學第一附屬醫院超聲科，云南 昆明 650032)

甲狀腺結節發病率達70%。采用微波消融原位滅活可致腫瘤細胞壞死，但消融過程中過高熱能可能損傷周圍組織[1]。細胞凋亡是啟動自主程序性死亡的過程[2]，誘導凋亡所需消融能量或化學治療(簡稱化療)劑量通常較低，可顯著提升治療的安全性。目前多通過實驗室檢測方法識別和評價凋亡，如光鏡/電鏡下觀察形態學、檢測DNA片段、凋亡相關基因及產物等[3]。膜聯蛋白Ⅴ(annexin Ⅴ)實驗室檢測細胞凋亡已得到廣泛臨床應用，核素顯像及CT、MRI分子影像領域相繼開展了相關實驗研究，但以聲學顯影方法實時識別凋亡的研究報道較少。本研究嘗試制備可靶向識別凋亡細胞的超聲微泡(microbubbles, MB)，并評價其體外識別凋亡細胞的能力，旨在以簡便直觀的影像學方法判定腫瘤凋亡及凋亡范圍。

1 材料與方法

1.1 主要材料 CAL-62人甲狀腺未分化癌細胞株(北納生物)，annexin Ⅴ抗體、山羊抗兔IgG-FITC(Abcom公司)，親和素(avidin，Sigma-Aldrich公司)，二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dipalmitoyl phosphatidyl choline， DPPC)、甲氧基聚乙二醇(methoxypolyethylene glycols， MPEG)200、二棕櫚酰基磷脂酸(dipalmitoyl phosphonic acid， DPPA)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(distearoylphosphatidylethanolamine-polyethylene glycol， DSPE-PEG)2000、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-生物素(dipalmitoylphosphatidylethanolamine-polyethylene glycol-biotin， DSPE-PEG-Biotin)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dipalmitoylphosphatidylethanolamine-polyethylene glycol， DSPE-PEG)200(Avanti公司)，細胞培養液Hyclone(DMEM公司)，annexin Ⅴ/碘化丙啶(annexin Ⅴ/propidium iodide， annexin Ⅴ/PI)凋亡試劑盒(BD公司)，一步法Tunel細胞凋亡原位檢測試劑盒(KeyGEN BioTECH公司),細胞膜紅色熒光探針(DiI，索萊寶公司)。

1.2 主要儀器 Olympus熒光顯微鏡，RHERMO臺式高速冷凍離心機，威爾德機械振蕩儀，Malvern表面電位儀，康友微波消融儀，諾禾致源流式細胞儀。

1.3 制備MB 取DPPC、MPEG200、DPPA、DSPE-PEG2000-Biotin，按摩爾比80∶5∶5∶10充分混懸后分裝于3 ml西林瓶中，采用特定凍干工藝程序，全氟丙烷置換空氣，加入溶酶液(三羥甲基氨基甲烷∶甘油∶丙二醇體積比為8∶1∶1)制成生物素化MB，充分振蕩、離心洗滌后依次加入avidin、annexin Ⅴ抗體、山羊抗兔IgG-FITC，孵育20 min后離心洗滌制得FITC標記的annexin Ⅴ靶向MB。

取DPPC、MPEG200、DPPA及DSPE-PEG2000，按相同摩爾比充分混懸，經凍干工藝程序后，全氟丙烷置換空氣，加入溶酶液，機械振蕩儀充分振蕩后得到普通MB。

1.4 評價annexin Ⅴ靶向MB理化性質及穩定性 將50 μl靶向MB 加入100 ml電解液中，采用粒徑分析儀測量粒徑分布范圍、以表面電位儀測量Zeta電位后置入4℃冰箱內避光保存。于制成時、制成7天、14天及1個月后于鏡下觀察MB形態大小及分布情況；取1 ml靶向MB原液，以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)稀釋10倍，加入血球計數板，鏡下計數3次，取平均值計算平均濃度：MB濃度(MB數/ml)=80小格MB數/80×400×104×稀釋倍數。

1.5 獲取凋亡CAL-62細胞初步篩選最佳消融參數 將CAL-62細胞傳代種植于直徑35 mm培養皿中，生長至對數期，分為消融組(以1～15 W、2～5 min進行分組消融)及對照組(僅插入電極)；將微波電極斜插入培養皿，電極勻速均勻轉動，均勻加熱使細胞受熱。消融結束后以胰酶消化離心，采用annexin Ⅴ/PI凋亡試劑盒及流式細胞術檢測凋亡情況，記錄并分析數據，獲得最佳消融參數。

1.6 鑒定凋亡細胞

1.6.1 流式細胞術及Tunel試驗檢測細胞凋亡 采用最佳消融參數再次對細胞進行微波消融，先后加入annexin Ⅴ與PI，孵育后采用流式細胞儀檢測。取一步法Tunel細胞凋亡原位檢測試劑盒，按說明操作，之后于熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。(即A、B、C共3組)

1.6.2 觀察annexin Ⅴ靶向MB特異性結合凋亡細胞 取3份腫瘤細胞，每份計數約2×104個，對其中2份行微波消融，1份作為對照而不予處理，觀察其尋靶情況。A組(凋亡細胞+普通MB)：取凋亡腫瘤細胞，以PBS洗滌3次，加入普通MB孵育20 min后再以PBS輕柔緩慢沖洗3次，置于普通光學顯微鏡下觀察。B組(正常細胞+靶向MB)：取正常細胞。C組(凋亡細胞+靶向MB)：取凋亡腫瘤細胞。對B組及C組細胞以PBS洗滌3次，加入DiI細胞膜染料，避光孵育15 min后以PBS洗滌3次，加入annexin Ⅴ靶向MB，避光孵育20 min后再以PBS輕柔緩慢沖洗3次，置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 鏡下觀察MB 普通光鏡及熒光顯微鏡下，annexin Ⅴ靶向MB和普通MB分布均勻，為大小一致的泡狀結構(圖1A、1B)；熒光顯微鏡下，靶向MB呈花環狀綠色熒光結構(圖1C)，普通MB不發出熒光(圖1D)。

圖1 顯微鏡鏡下annexin Ⅴ靶向MB與普通MB圖像(×200) A、B.光鏡下觀察annexin Ⅴ靶向MB(A)與普通MB(B)； C、D.熒光顯微鏡下觀察annexin Ⅴ靶向MB(C)與普通MB(D)

2.2 靶向MB理化性質及穩定性 annexin Ⅴ靶向MB大小均一，分布均勻，理化性質穩定，平均粒徑(0.78±0.06)μm，Zeta電位為(-22.70±1.80)mV(圖2)。制成時、制成7天、14天及1個月后靶向MB平均濃度分別為4.23×108/ml、2.70×108/ml、2.21×107/ml及3.70×105/ml。隨時間延長，鏡下所見MB粒徑逐漸增大、分布由均勻轉為聚集，熒光強度則逐漸減弱。

圖2 annexin Ⅴ MB粒徑分析結果

2.3 細胞消融最佳參數 隨功率增加，不同消融時間下細胞存活率總體呈下降趨勢，凋亡率及死亡率總體呈上升趨勢，死亡率升高時凋亡率相對有所下降；微波消融CAL-62細胞最佳參數為功率10 W、時間3 min(圖3)。

圖3 不同消融時間細胞存活率(A)、凋亡率(B)及死亡率(C) (箭示最佳消融參數)

2.4 鑒定凋亡細胞 根據細胞凋亡早期膜內磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine， PS)外翻至膜外、可與annexin Ⅴ高親和力結合而PI可進入晚期凋亡及死細胞包膜內，可區分活細胞、早期、晚期凋亡及死細胞(圖4)。

圖4 流式細胞術鑒定凋亡細胞 Q1、Q2、Q3、Q4分別為死亡、晚期凋亡、活細胞及早期凋亡細胞占比

Tunel檢測法：以紅色熒光素標記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸在末端脫氧核苷酸轉移酶作用下可與凋亡細胞內DNA斷鏈3’-OH末端鏈接；凋亡細胞細胞質內的斷鏈DNA在熒光顯微鏡下呈紅色熒光，以DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)復染細胞核后，凋亡與非凋亡細胞的細胞核在熒光顯微鏡下呈藍色，二者重合而呈紫紅色，即為凋亡細胞(圖5)。

圖5 消融后細胞Tunel實驗merge圖(×100) 藍色胞核與紅色熒光核酸斷鏈重合呈紫紅色，即為凋亡細胞

2.5 annexin Ⅴ靶向MB體外識別凋亡細胞 A組：熒光顯微鏡下僅見消融后腫瘤細胞，未見與凋亡細胞穩定結合的普通MB(圖6A)；B組：鏡下僅見正常細胞，未見正常細胞與靶向MB穩定結合(圖6B)；C組：鏡下見凋亡細胞與annexin Ⅴ靶向MB穩定結合(圖6C、6D)。

圖6 鏡下annexin Ⅴ MB體外尋靶圖(×100) A、B.分別為熒光顯微鏡下觀察A組及B組； C、D.鏡下觀察C組，細胞標記為紅色熒光，靶向MB標記為綠色熒光

3 討論

為有效消融甲狀腺腫瘤，臨床多選擇高功率、長時間消融模式，其所帶來的過高熱能易損傷周圍組織，引起不可逆的并發癥[1]；而以低能級超聲誘導腫瘤細胞凋亡[4]同樣可達到治療目的，若治療過程中能夠識別凋亡和凋亡范圍，則可在提高治療安全性的同時保證其有效性，具有重要臨床應用價值。

annexin Ⅴ對凋亡早期自細胞膜內側外翻至膜外的PS具有高親和力[5]，將annexin Ⅴ加載到超聲MB上，即可制備出能夠靶向識別凋亡細胞的新型功能性MB。本實驗采用生物素化MB鏈接親和素，進一步結合annexin Ⅴ及熒光二抗的方法成功制備了粒徑小、大小均一、性質穩定的annexin Ⅴ靶向MB。生物素-親和素系統是已知最強的非共價作用，每個親和素分子有4個生物素結合位點[6]，呈多級放大模式，可避免浪費抗體，保證抗體高攜載率；按特定順序制泡，逐步分離、提純未與MB鏈接的親和素、抗體及脂質膜碎片[7]，可提高靶向MB純度。

目前關于微波治療的臨床應用研究較多，但應用凋亡理論避免毒副損傷的報道較少。為驗證annexin Ⅴ靶向MB的特異性識別能力，首先需獲取凋亡細胞。有學者[8]采用順鉑或紫杉醇等化療藥物誘導腫瘤細胞發生凋亡，再進行體外尋靶。本實驗采用微波消融腫瘤細胞，經流式細胞術及Tunel檢測，驗證了微波消融可誘導CAL-62細胞凋亡，為annexin Ⅴ MB體外尋靶奠定了基礎。為保證后續實驗效果，首先進行預實驗，篩選消融參數，獲取了凋亡率最佳的細胞樣本。體外尋靶實驗中，A組、B 組細胞均不具備靶向對應性，未見與細胞穩定結合的MB；而C組annexin Ⅴ靶向MB可與凋亡細胞外翻的PS高親和度結合，提示相對于普通MB，annexin Ⅴ靶向MB識別凋亡細胞具有高度特異度與敏感度。

既往相關研究[9-10]多利用超聲MB攜載靶向配體、治療藥物或基因，并取得了一定成果。目前靶向MB多用于對局部組織的特異性尋靶，以針對性診斷特定疾病。本實驗制備的靶向MB未添加特異性識別特定腫瘤的靶向分子，僅針對性識別凋亡細胞外翻的PS分子[5]，可用于檢測正常組織及腫瘤組織等細胞凋亡狀況，并有望由此建立無創識別凋亡細胞的特異性靶向顯影方法[8]，評估臨床抗癌療效，減少治療過程中正常組織的損傷，降低并發癥風險。

本研究不足之處在于annexin Ⅴ靶向MB體外識別凋亡細胞僅是初步尋靶體外實驗，其體內顯影效果有待觀察；且需進一步改進設計，提高制備annexin Ⅴ靶向MB的成功率。