O、A、Asia 1型口蹄疫病毒膠體金定量檢測免疫層析方法的建立

李 昕，孫燕燕，林 密，陳夏輝，李峰松，包艷芳，楊 光，蔣 韜

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730046)

口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是一種高度接觸性傳染病，在全世界廣泛流行，嚴(yán)重影響了畜牧業(yè)發(fā)展，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。口蹄疫病毒(FMDV)有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3、Asia1型7種血清型，且各血清型之間無交叉保護(hù)性，因此，對不同血清型的快速鑒別診斷可以有效預(yù)防和控制口蹄疫[3-5]。同時(shí)，在口蹄疫長期流行的地區(qū)，確定流行區(qū)血清型對于接種疫苗的選擇以及追蹤傳染源至關(guān)重要[6]。接種口蹄疫疫苗是預(yù)防口蹄疫暴發(fā)的最有效措施。近年來，在中國流行的口蹄疫病毒為O、A血清型，針對這一流行情況，在疾病的流行地區(qū)主要免疫的為單一血清型的滅活疫苗或O型、A型雙價(jià)滅活疫苗。為了保證動(dòng)物得到有效的免疫接種，在生產(chǎn)中應(yīng)該嚴(yán)格控制疫苗質(zhì)量[7-9]。目前，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的生產(chǎn)毒種和疫苗的效力檢驗(yàn)是通過在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，計(jì)算疫苗的PD50完成，此方法是最為可靠評價(jià)疫苗效力的方法，有較高的生物安全要求[10-11]。但對于不同批次，不同階段生產(chǎn)細(xì)胞毒的有效抗原含量評價(jià)，使用此方法會(huì)消耗大量的人力、物力和時(shí)間，檢驗(yàn)成本巨大，效率低，無法滿足現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中間產(chǎn)品、成品的快速檢驗(yàn)的需求。為了解決這一問題，許多生產(chǎn)企業(yè)已經(jīng)衍生出許多體外檢測疫苗中間品和成品中有效抗原含量的方法。

蔗糖密度梯度(sucrose density gradient, SDG)法是其中比較常見的一種。它根據(jù)沉降系數(shù)將FMDV分為146S、75S、45S和12S。完整的病毒顆粒146S具有較強(qiáng)的免疫原性，并且是病毒顆粒中的主要免疫原，因此，在疫苗生產(chǎn)中將146S含量的檢測作為檢測疫苗效力的重要指標(biāo)[12-14]。但該方法不能同時(shí)檢測多價(jià)疫苗中各血清型病毒的146S含量，操作程序繁瑣，需要昂貴的超速離心機(jī)，檢測時(shí)間較長[15]。近期較為新穎的排阻高效液相色譜法，利用抗原分子量大小分析疫苗制劑中146S的含量，但仍需要配備專項(xiàng)設(shè)備及專業(yè)技術(shù)人員，檢測成本較高[16]。用多抗、單抗、單域抗體等材料構(gòu)建的ELISA方法可以檢測FMDV不同血清型的146S含量[17-19]，雖然有些方法敏感性較高，但特異性較差，與12S有交叉反應(yīng)[20]，或者與疫苗效力檢驗(yàn)和SDG兩種方法的相關(guān)性不夠高[17]。此外，敏感性較高的熒光定量RT-PCR可以檢測細(xì)胞毒或疫苗中的病毒基因數(shù)量，但不能保證檢測到的是完整的病毒顆粒，而且操作不當(dāng)會(huì)產(chǎn)生一定的誤差[21-22]。雖然ELISA、RT-qPCR等方法大大縮短檢測的時(shí)間，操作相對簡化，但中間產(chǎn)品留觀時(shí)間有限，仍需要更為簡便快捷的方法來檢測疫苗中的146S含量，提高疫苗生產(chǎn)效率。

免疫層析檢測技術(shù)(immunochromatographic assay, ICA)是一種經(jīng)典的即時(shí)檢測技術(shù)，基于抗體和抗原之間的免疫反應(yīng)，它可以快速、簡單地檢測目標(biāo)抗原或抗體。目前，免疫層析技術(shù)通過與試紙條讀數(shù)儀的結(jié)合，可以定量檢測目標(biāo)抗原，并且特異性好，敏感性與ELISA可達(dá)到同一數(shù)量級(jí)[23-26]。已經(jīng)有報(bào)道的關(guān)于口蹄疫病毒的免疫層析檢測方法，但僅限于抗原的鑒別診斷[27]。同時(shí)，對疫苗使用者來說，快速、準(zhǔn)確測定口蹄疫病毒滅活疫苗中的病毒含量，對篩選有效的口蹄疫防疫疫苗具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。

本研究中，作者建立了一種基于膠體金免疫層析技術(shù)的口蹄疫病毒定量檢測方法，利用特異性抗體制備出可以分別檢測FMDV O、A、Asia 1型病毒的膠體金檢測試紙卡，通過檢測已知146S含量的病毒擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線，評價(jià)建立方法的靈敏度。本研究建立的方法不僅可以鑒別診斷FMDV O、A、Asia 1型病毒，還可以定量檢測病毒中146S含量，為疾病的預(yù)防和監(jiān)測，以及疫苗生產(chǎn)中的質(zhì)量控制提供快速、準(zhǔn)確、廉價(jià)的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑及材料

牛血清白蛋白(BSA)、三水合四氯金酸(Merk, USA)、檸檬酸三鈉、碳酸鉀等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純，NC膜、玻璃纖維、PVC背襯板(上海捷寧生物科技有限公司)。

口蹄疫O、A、Asia 1型滅活細(xì)胞毒，其毒株分別為O/Mya98/BY/2010，AF/72，Asia 1/JSL，口蹄疫O型、A型二價(jià)滅活疫苗(Re-O/Mya98/JSCJ/2013株+Re-A/WH/09株)，口蹄疫O型滅活疫苗(O/Mya98/JSCJ/2010株)，由中農(nóng)威特生物科技股份有限公司提供。口蹄疫O、A型滅活乳鼠毒、水皰液等組織毒，毒株分別為O/Mya98、O/CATHAY、O/Ind/2001、O/PanAsia、A/Sea/97，由蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室提供。塞內(nèi)卡病毒A型(SVA)、豬水皰病病毒(SVDV)、豬水皰性口炎病毒(VSV)滅活培養(yǎng)物，為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 設(shè)備

Sorvall WX100超速離離心機(jī)(Thermo Scientific， USA)，Pharmacia FPLC純化系統(tǒng)(Merk，USA)，HiTrap Protein A HP親和層析柱(GE，Sweden)，紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)，三維平面點(diǎn)膜噴金儀(Biodot，USA)，試紙條切條機(jī)(上海韓感電子科技有限公司)，金標(biāo)條閱讀儀(杭州奧盛儀器有限責(zé)任公司)

1.3 抗原篩選

1.3.1 抗原制備 選取口蹄疫O型疫苗毒株O/Mya98/BY/2010、O/GX/09-7、Re-O/Mya98/JSCZ/2013、O/PanAsia/TZ/2011，口蹄疫A型疫苗毒株Re-A/WH/09、AF/72，將以上毒株滅活后作為檢測用抗原。

1.3.2 抗原反應(yīng)性鑒定

1.3.2.1 間接ELISA方法的建立：將以上幾種抗原分別用0.05 mol·L-1碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋到0.5 mg·L-1的濃度，以100 μL·孔-1包被酶標(biāo)板，PBST洗滌3次。加入0.1% BSA封閉液300 μL·孔-1，37 ℃封閉1 h后PBST洗滌。待檢血清[口蹄疫O、A型病毒不同毒株(詳見“1.3.1”)抗體陽性血清]、陽性[口蹄疫O型病毒(O/Mya98)高免血清]和陰性對照血清(口蹄疫抗體陰性血清)按照1∶50稀釋，100 μL·孔-1，60 min后PBST同上洗滌。最適稀釋度的酶標(biāo)二抗(HRP標(biāo)記兔抗豬IgG抗體)100 μL·孔-1， 45 min后PBST同上洗滌。加入TMB底物顯色，100 μL·孔-1，10 min 后加入終止液100 μL ·孔-1終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取OD450 nm值。判定標(biāo)準(zhǔn)：血清樣本抗體效價(jià)(S/P)=(OD450 nm樣品-OD450 nm陰性)/(OD450 nm陽性-OD450 nm陰性)，當(dāng)效價(jià)≥0.30，判定為陽性；效價(jià)<0.25，判定為陰性。效價(jià)0.25～0.30間判為可疑，兩次可疑結(jié)果判定為陰性。

1.3.2.2 間接ELISA檢測不同抗原反應(yīng)性：通過建立不同毒株為診斷抗原的間接ELISA，分別檢測40份口蹄疫O型不同毒株免疫血清，及60份口蹄疫A型不同毒株免疫血清。根據(jù)陽性檢出率確定不同毒株抗原的反應(yīng)性，選擇反應(yīng)性最好的抗原作為免疫層析方法診斷抗原。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

1.4.1 純凈性檢測 采用多重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法[28]，檢測每種滅活口蹄疫病毒的血清型，選擇只含單一血清型的純凈細(xì)胞毒作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品抗原含量的檢測 分別將口蹄疫病毒O、A、Asia 1型滅活細(xì)胞毒反復(fù)凍融3次后4 ℃ 8 000 r·min-1離心10 min，收集上清，加入2倍 體積三氯乙烯充分震蕩混勻后4 ℃ 10 000 r·min-1離心20 min，收集上層液體。將收集的液體4 ℃ 30 000 r·min-1離心3 h后棄去上清，將沉淀用NET緩沖液(100 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA，50 mmol·L-1Tris-HCl)懸浮后充分研磨。研磨后的濃縮抗原采用蔗糖密度梯度法純化病毒146S[15]。在離心管中依次加入50%～10%蔗糖溶液，制成蔗糖密度梯度柱。將濃縮病毒抗原液加入蔗糖梯度柱頂部，4 ℃，35 000 r·min-1離心2.5 h。以0.5 mL作為1個(gè)收集級(jí)分，依次從上到下逐層收集并編號(hào)。分別收集所有級(jí)分，采用紫外分光光度計(jì)測定OD259 nm并確定146S的含量，將OD259 nm大于0.5的層級(jí)合并，作為有效抗原4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 定量試紙卡制備

1.5.1 口蹄疫病毒多抗制備 按照“1.4.2”中方法分別濃縮O型、A型、Asia 1型口蹄疫病毒中的有效抗原，在濃縮抗原加入弗氏佐劑混勻，制成油乳劑，免疫家兔及豚鼠，采集動(dòng)物免疫血清。

將HiTrap Protein A親和層析柱安裝至Pharmacia FPLC純化系統(tǒng)，按操作流程純化豚鼠及兔血清，作為口蹄疫病毒豚鼠抗及兔抗，純化后的抗體用紫外分光光度計(jì)確定抗體含量。

1.5.2 抗體的標(biāo)記 按照文獻(xiàn)中方法制備膠體金溶液[29]。用0.2 mol·L-1的K2CO3溶液，將5 mL膠體金溶液調(diào)整至標(biāo)記最適pH，之后加入最佳標(biāo)記量的純化兔抗，攪拌30 min，在膠體金溶液中加入終濃度為1% BSA，攪拌30 min，10 000 r·min-1離心30 min， 去上清，所得沉淀溶解于0.25 mL膠體金緩沖液中，置于4 ℃保存。

1.5.3 NC膜上的口蹄疫豚鼠抗包被濃度篩選 將純化豚鼠抗稀釋為不同濃度，分別將每個(gè)濃度的豚鼠抗作為檢測帶用點(diǎn)膜噴金儀噴涂于NC膜上(1 μL·cm-1)，同時(shí)，將羊抗兔IgG稀釋至0.5 mg·mL-1， 噴涂在NC膜上作為質(zhì)控帶，噴涂完成后將NC膜置于37 ℃干燥1 h，4 ℃干燥保存。將包被了不同濃度豚鼠抗的NC膜組裝成試紙卡來檢測口蹄疫O型、A型、Asia 1型病毒標(biāo)準(zhǔn)品，每份樣品檢測3次，比較試紙卡檢測同種血清型與其他兩種血清型樣品的T/C差值，選擇差值最大時(shí)對應(yīng)的豚鼠抗?jié)舛茸鳛樽钸m包被濃度。

1.5.4 試紙卡組裝 標(biāo)記好抗體的膠體金溶液噴涂于玻璃纖維上作為金標(biāo)墊(conjugate pad)，37 ℃ 干燥1 h，4 ℃干燥保存。將金標(biāo)墊、樣品墊(sample pad)、NC膜(NC membrane)、和吸收墊(absorb pad)粘貼在PVC背襯板上，然后裝入卡殼中，如圖1所示。

圖1 試紙卡示意圖Fig.1 Schematic diagram of test paper card

1.6 樣品處理方法

1.6.1 樣品前處理 將正丁醇與4倍體積的油乳劑滅活疫苗充分混勻，4 ℃，3 000 r·min-1離心10 min，離心后的最下層的病毒抗原作為待檢樣品，置于4 ℃?zhèn)溆谩缁钊槭蠖? ℃，3 000 r·min-1離心10 min，取上清作為待檢樣品，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｋ捯骸缁罴?xì)胞毒可直接作為待檢樣品。

1.6.2 稀釋倍數(shù)配伍試驗(yàn) 分別將不同體積的標(biāo)準(zhǔn)品(口蹄疫O、A、Asia 1型口蹄疫滅活細(xì)胞病毒)、口蹄疫O型、A型二價(jià)滅活疫苗與樣品稀釋液組合配對(表1)，試紙卡的總載樣量為90 μL，將處理好的樣品滴加在試紙卡上，檢測樣品在不同稀釋倍數(shù)下的T/C值。

表1 樣品及稀釋液的配伍組合

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

1.7.1 定量閾值 取空白對照(樣品稀釋液)，BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)物5份，健康乳鼠組織研磨液上清5份，每份樣品檢測3次(n=33)。此外，每種血清型試紙卡分別檢測其他兩種異型滅活細(xì)胞毒各3份， 每份檢測3次(n=18)。將空白對照及陰性樣品T/C平均值+10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差作為定量閾值。

1.7.2 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線 將標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋，分別將每個(gè)稀釋度的樣品將制備好的試紙卡平行檢測3次， 檢測所得的樣品T/C值，結(jié)合其相應(yīng)的抗原含量，擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線。將標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋，分別將每個(gè)稀釋度的樣品用制備好的試紙卡檢測3次，根據(jù)測得的T/C值與已知的病毒有效含量，擬合出定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 檢測方法評價(jià)

1.8.1 特異性檢測 分別取制備好的FMDV O、A、Asia 1型試紙卡檢測SVA、SVDV、VSV滅活培養(yǎng)物，此外，用每種試紙卡檢測每種血清型滅活病毒、滅活乳鼠毒、水皰液及滅活疫苗。每份樣品檢測3次，檢測后所得T/C平均值減去定量閾值，所得數(shù)值>0，判定為陽性，所得數(shù)值<0，判定為陰性。

1.8.2 與SDG方法檢測結(jié)果比較 分別選取口蹄疫O型、A型、Asia 1型滅活細(xì)胞毒各10份，用已經(jīng)建立的試紙卡檢測方法檢測所有樣品中的FMDV 146S含量，每份樣品檢測3次，取3次檢測的平均值與傳統(tǒng)的SDG方法檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

1.8.3 重復(fù)性試驗(yàn) 分別將口蹄疫O、A、Asia 1型滅活病毒標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋至24倍，分別用試紙卡將每個(gè)稀釋度的樣品檢測3次，確定建立方法的重復(fù)性。

1.9 符合性試驗(yàn)

1.9.1 符合性試驗(yàn) 用已經(jīng)建立的試紙卡檢測方法分別檢測口蹄疫O、A、Asia 1型滅活乳鼠毒，共18份，以及由多重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法確定的口蹄疫田間樣本38份，含水皰液共15份，水皰皮18份，扁桃體及淋巴結(jié)5份。試紙卡檢測樣品后所得T/C值減去定量閾值，所得數(shù)值>0，判定為陽性，所得數(shù)值<0，判定為陰性。通過對已知血清型的樣品檢出數(shù)來評價(jià)試紙條的符合率。

乳酸鏈球菌素是一種抗菌素,由乳酸菌屬的乳酸鏈球菌制得,乳酸鏈球菌素不能抑制革蘭氏陰性菌、酵母和霉菌,能抑制葡萄球菌屬、鏈球菌屬、小球菌屬和乳桿菌屬的某些菌種；對于抑制LAB和其它革蘭氏陽性細(xì)菌,特別是梭菌和細(xì)菌芽孢極其有效[5]。乳酸鏈球菌素就作為一種防腐劑在食品中使用。能產(chǎn)生細(xì)菌素的乳酸菌作為一種新型發(fā)酵劑被廣泛用于發(fā)酵肉制品工業(yè),能有效地抑制引起食品腐敗的細(xì)菌和孢子,延長食品的貨架期[6]。

1.9.2 不同毒株待檢樣品的敏感性檢測 將“1.9.1”中的檢測樣品以及O型、A型、Asia 1型滅活細(xì)胞毒各10份用已經(jīng)建立的試紙卡檢測方法檢測所有樣品中的FMDV 146S含量，根據(jù)每種毒株的陽性檢出率來確定對同血清型不同毒株的敏感性。

2 結(jié) 果

2.1 不同抗原反應(yīng)性比較

用口蹄疫O型疫苗毒株O/Mya98/BY/2010、O/GX/09-7、Re-O/MYA98/JSCZ/2013、O/PanAsia/TZ/2011，口蹄疫A型疫苗毒株Re-A/WH/09、AF/72建立的間接ELISA方法分別檢測40份口蹄疫O型免疫血清及60份口蹄疫A型免疫血清，檢測結(jié)果見表2。4種口蹄疫O型毒株對O型免疫血清的檢出率不同，其中，O/Mya98/BY/2010做診斷抗原對不同毒株的陽性檢出率最高，為92.5%，敏感性高。2種口蹄疫A型毒株中，對A型不同毒株免疫血清的檢出率較高的為AF/72株，陽性檢出率90%。因此，選擇敏感性高的O/Mya98/BY/2010及AF/72分別作為診斷抗原毒株。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品特異性 用多重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR分別檢測口蹄疫O型、A型、Asia 1型滅活細(xì)胞毒，每種滅活細(xì)胞毒均為純凈細(xì)胞毒，無其他血清型病毒核酸。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)抗原含量檢測 濃縮后的抗原分布在蔗糖柱的各個(gè)級(jí)分，各級(jí)分在259 nm處的光吸收值如圖2所示。得到的口蹄疫O型、A型、Asia 1型滅活細(xì)胞毒標(biāo)準(zhǔn)品中有效抗原146S的含量分別為53.87、64.00、58.72 μg·mL-1。

2.3 NC膜上捕獲抗體濃度

當(dāng)NC膜上的O型豚鼠抗?jié)舛葹?.393 μg·mL-1時(shí)，試紙卡檢測O型標(biāo)準(zhǔn)品的T/C值與其他兩種血清型標(biāo)準(zhǔn)品的差值最大，作為最佳包被濃度。當(dāng)NC膜上的A型豚鼠抗?jié)舛葹?.654 μg·mL-1時(shí)，試紙卡檢測A型標(biāo)準(zhǔn)品的T/C值與與其他兩種血清型標(biāo)準(zhǔn)品的差值最大，為最佳包被濃度。當(dāng)NC膜上的Asia 1型豚鼠抗?jié)舛葹?.743 μg·mL-1時(shí)，試紙卡檢測Asia 1型標(biāo)準(zhǔn)品的T/C值與與其他兩種血清型標(biāo)準(zhǔn)品的差值最大，為最佳包被濃度(圖3)。

2.4 樣品的檢測

根據(jù)表1中的不同稀釋比例檢測陽性滅活細(xì)胞毒及滅活疫苗，在待檢樣品為20 μL，樣品稀釋液為70 μL時(shí)，試紙卡檢測陽性滅活細(xì)胞毒及疫苗所得的T/C值最大(圖4)，為最佳的檢測方式。

2.5 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低檢測限

用FMDV-O型試紙卡檢測空白對照、O型及A型標(biāo)準(zhǔn)品，T/C平均值為0.033，標(biāo)準(zhǔn)差(s)為0.028，閾值為0.303。用FMDV-A型試紙卡檢測空白對照，O型及Asia 1型標(biāo)準(zhǔn)品，T/C平均值為0.025，s為0.021，閾值為0.23。用FMDV- Asia 1型試紙卡檢測空白對照，O型及A型標(biāo)準(zhǔn)品，T/C平均值為0.015，s為0.009，閾值為0.095。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品擬合出的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)，O、A、Asia 1型試紙卡的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.972、0.973、0.977。在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，由定量曲線公式可得，口蹄疫O、A、Asia 1型試紙卡的定量最低限值分別為0.567、0.693、0.219 μg·mL-1。

表2 不同診斷抗原的抗體陽性檢出率

圖2 O型、A型、Asia 1型口蹄疫病毒各級(jí)分146S OD259nmFig.2 The OD259nm values of FMDV 146S with all fractions

2.6 特異性檢測

分別用O、A、Asia 1型試紙卡檢測SVA、SVDV、VDV均為陰性結(jié)果，每種血清型試紙卡檢測其他血清型的滅活細(xì)胞毒、滅活乳鼠毒、水泡液及滅活疫苗，結(jié)果均為陰性，3種試紙卡之間無交叉反應(yīng)(圖6)。

2.7 與SDG方法的比較

每種血清型的試紙卡分別檢測相應(yīng)血清型的10份樣品，與SDG法檢測結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。3種血清型的試紙卡與SDG檢測結(jié)果的相關(guān)性均高于0.9(圖7)，說明兩種方法的相關(guān)性良好。

2.8 重復(fù)性檢測

口蹄疫病毒O型試紙卡檢測5份不同稀釋度的O型滅活病毒標(biāo)準(zhǔn)品，每份樣品檢測3次，檢測結(jié)果的變異系數(shù)(CV)為9.6%；口蹄疫病毒A型試紙卡檢測5份不同稀釋度的A型滅活病毒標(biāo)準(zhǔn)品，每份樣品檢測3次，檢測結(jié)果的CV為4.7%；口蹄疫病毒Asia 1型試紙卡檢測5份不同稀釋度的Asia 1型 滅活病毒標(biāo)準(zhǔn)品，每份樣品檢測3次，檢測結(jié)果的CV為9.8%。建立的O、A、Asia 1型口蹄疫病毒膠體金定量檢測免疫層析方法重復(fù)性良好。

2.9 符合性試驗(yàn)

2.9.1 待檢樣品符合率 檢測18份口蹄疫滅活乳鼠毒樣本及38份田間樣本，共56份,由表3可知，口蹄疫O型、A型、Asia 1型樣品的符合率分別為84.21%、66.67%、100%，樣品總符合率為80.36%。

A. FMDV-O型試紙卡檢測O型及滅活抗原所得T/C值與A型、Asia1型滅活抗原的差值；B. FMDV-A型試紙卡檢測A型及滅活抗原所得T/C值與O型、Asia1型滅活抗原的差值；C. FMDV-Asia 1型試紙卡檢測Asia 1型及滅活抗原所得T/C值與O型、A型滅活抗原的差值A(chǔ). Difference of T/C value with inactivated antigen of serotype O vs. serotype A and Asia 1 by FMDV-O ICA; B. Difference of T/C value with inactivated antigen of serotyps A vs. serotype O and Asia 1 by FMDV-A ICA; C. Difference of T/C value with inactivated antigen of serotypes Asia 1 vs. serotype O and A by FMDV-Asia 1 ICA圖3 NC膜上包被不同濃度抗體試紙卡檢測結(jié)果Fig.3 Results of ICA with different antibody concentrations on the NC membrane

圖4 不同稀釋倍數(shù)樣品檢測結(jié)果Fig.4 The results of samples with different volume multiples

2.9.2 不同毒株的待檢樣品檢測結(jié)果 分別用制備好的口蹄疫O型、A型、Asia1型定量檢測試紙卡檢測同血清型不同毒株的樣品，如圖8所示，O型試紙卡檢測毒株O/Mya98、O/CATHAY、O/Ind/2001、O/PanAsia、A/Sea/97的陽性檢出率分別為95%、70%、90%、87.5%， A型試紙卡檢測毒株A/Sea/97、AF/72的陽性檢出率分別為60%、85%，Asia 1型試紙卡檢測毒株Asia1/JSL的陽性檢出率為100%。

3 討 論

2010—2016年，中國地區(qū)流行的口蹄疫病毒血清型主要為O型及A型[1-2]，Asia 1型口蹄疫病毒曾在2005—2008年暴發(fā)過[30-33]，但近年來，由于政府采取了一系列控制措施，包括強(qiáng)制性常規(guī)疫苗接種，該血清型已經(jīng)無任何感染的病例，因此，在生產(chǎn)養(yǎng)殖中已不將Asia 1型疫苗的免疫作為重點(diǎn)，但會(huì)密切地監(jiān)測Asia 1型病毒的流行情況。本研究中設(shè)計(jì)了O、A、Asia 1 3種血清型的即時(shí)檢測方法，這3種血清型在國內(nèi)都有過長期和大面積的暴發(fā)，作為檢測技術(shù)應(yīng)有全面評價(jià)并進(jìn)行技術(shù)儲(chǔ)備，研究過程并沒有剔除Asia 1型。雖然缺乏Asia 1型疫苗樣品，但通過使用滅活細(xì)胞病毒及乳鼠傳代毒的檢測，并與其他兩種血清型疫苗定量結(jié)果的平行分析，依然獲得較為真實(shí)可信的結(jié)果。

圖5 口蹄疫病毒O型、A型、Asia 1型免疫層析試紙卡定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Linear standard curve of ICA of serotypes O, A and Asia 1

x 軸代表不同的樣品，y 軸代表對應(yīng)樣品所測得的T/C值與定量閾值之差The x-axis refers to the different samples; the y-axis refers to the difference between T/C value with corresponding virus samples and quantitative threshold圖6 每種血清型試紙條特異性檢測結(jié)果Fig.6 Specificity of each chromatographic strips

圖7 ICA與SDG檢測結(jié)果相關(guān)性分析Fig.7 Correlation between the ICA and SDG

表3 符合性試驗(yàn)

圖8 O型、A型、Asia 1型試紙卡不同毒株陽性檢出率Fig.8 The positive detection rate of lateral flow assay of FMDV-O, FMDV-A and FMDV-Asia 1

傳統(tǒng)的SDG方法只是單純地檢測出病毒的146S含量，而當(dāng)檢測口蹄疫O、A雙價(jià)苗時(shí)，并不能同時(shí)檢測出其中每種血清型的病毒146S含量。試驗(yàn)顯示：本研究中建立的膠體金免疫層析檢測方法，不僅可以檢測多價(jià)苗中每種血清型病毒146S的含量，而且檢測單一血清型的滅活細(xì)胞毒或者疫苗與SGD的檢測結(jié)果具有高度一致性，因此，可以作為替代SDG的方法來定量檢測病毒146S的含量。SDG方法所需樣本的體積量大，對于某些樣品，如滅活乳鼠毒等，因樣本量少而無法用SDG方法進(jìn)行定量，因此在分析本研究建立的方法靈敏度時(shí)，不做相關(guān)性分析，而是與樣品背景進(jìn)行復(fù)核，定性比較。

對于定量膠體金層析快速檢測方法，NC膜上檢測帶抗體的濃度的選擇尤其重要，適宜的抗體濃度要保證檢測的敏感性，也要避免假陽性結(jié)果。在試驗(yàn)中，選擇最適抗體濃度包被NC膜檢測帶，通過對標(biāo)準(zhǔn)品檢測，當(dāng)二者T/C值的差值最大時(shí)，證實(shí)試紙卡特異性最佳，同時(shí)在保證特異性的前提下，選擇檢測陽性樣品T/C值最高時(shí)的抗體包被最低濃度為最適包被濃度。

在樣品處理上，對于滅活細(xì)胞毒可直接將樣品滴加在加樣孔中，但對于疫苗樣品，由于疫苗破乳、離心后的抗原成分在最下層，在吸取抗原時(shí)容易帶入油脂或正丁醇等雜質(zhì)，影響檢測結(jié)果，篩選了適宜的樣品稀釋液，確定最佳稀釋倍數(shù)，使得抗原抗體充分反應(yīng)，最大程度減少雜質(zhì)的影響，提高了檢測結(jié)果的靈敏度。

本研究中，為了確定檢測樣品的最高限值，選擇濃縮后的病毒抗原作為檢測樣品，將濃縮抗原稀釋為不同的濃度后檢測，通過Bland-Altman法分析與SDG檢測結(jié)果的一致性，選擇與SDG結(jié)果一致的最高濃度作為檢測方法的最高檢測限。此外，經(jīng)過不同樣本的驗(yàn)證，檢測結(jié)果均在本研究建立方法的定量范圍內(nèi)。

本方法在設(shè)計(jì)之初主要針對滅活抗原和疫苗有效抗原含量進(jìn)行評價(jià)，對于其他病毒樣品(包括水皰皮、水皰液、感染組織等)也進(jìn)行了檢測，對病毒含量較高水皰液和新鮮皰皮均可以直接判定血清型別，但對OP液、扁桃體等樣品敏感性稍低。由于組織樣品的定量分析，在實(shí)際應(yīng)用中無需求，田間樣品的快速定性使該方法具有更廣闊的應(yīng)用市場。

4 結(jié) 論

建立了口蹄疫O、A、Asia1型病毒膠體金免疫層析定量檢測試紙卡方法，可以用于口蹄疫病毒抗原快速鑒別、血清分型與146S定量檢測。