大黃酚對局灶性腦缺血再灌注小鼠缺血半暗帶區HIF-1α與VEGF表達的影響

房亞蘭 楊 楠 趙詠梅* 黃語悠 李錦程 段云霞 高 利 羅玉敏

(1. 北京市平谷區醫院全科醫療科，北京 101200； 2. 首都醫科大學宣武醫院 北京市老年病醫療研究中心，北京 100053)

缺血性腦血管病目前仍是全球范圍內的主要死因與長期殘疾的主要原因[1]。通過組織纖溶酶原激活劑tPA介導的溶栓和血管內血栓切除術是臨床治療急性缺血性腦血管病的主要有效手段，但卻受到狹窄的治療時間窗的限制，并且缺血后恢復血液供應也可造成再灌注損傷。因此，探索治療缺血性腦血管病的有效藥物具有重大意義。本課題組近年來的研究[2-3]表明，從大黃中提取的主要活性成分之一大黃酚(chrysophanol, CHR)對腦缺血再灌注損傷有神經保護作用，能提高腦缺血小鼠的生存率，減小腦梗死體積，并改善其神經功能評分，且CHR的腦保護作用可持續至再灌注后第14天，說明CHR在防治缺血性腦血管病方面具有潛在的臨床應用前景。但CHR對腦缺血再灌注損傷的長期保護作用機制目前尚不完全清楚。

缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)是HIF-1的誘導型調節亞單位。正常情況下，由于泛素蛋白酶體系統的快速降解，HIF-1α極不穩定，HIF-1α蛋白水平非常低甚至很難被檢測出來[4]。當組織缺血缺氧時，HIF-1α表達水平升高。HIF-1α在神經損傷中有雙刃劍的作用[5]。文獻[6]報道，顱腦損傷預后不良患者的血清中HIF-1α水平明顯高于預后良好組，HIF-1α的水平變化可作為腦損傷預后的預測指標之一。還有研究[7]顯示，新生大鼠腦缺氧缺血可誘導HIF-1α表達，HIF-1α表達的上調可導致神經元凋亡。筆者之前的研究[8]表明，在MCAO大鼠缺血側的腦組織中HIF-1α表達顯著增加，促進腦缺血再灌注損傷。說明HIF-1α表達上調可能是造成缺血性腦損傷中神經元死亡的重要原因之一。研究[9]顯示，大黃可通過抑制類風濕關節炎大鼠TNF-α-HIF-1α-iNOS-NO信號通路，減輕炎癥反應，從而延緩類風濕關節炎的進展。然而，HIF-1α是否參與CHR的腦保護作用，目前尚無研究報道。

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是一種能夠促進內皮細胞分裂的特異性有絲分裂原，其與內皮細胞上的受體結合可調節血管通透性、誘導血管的生成與神經修復[10]。VEGF還可直接作用于神經細胞，參與神經元形成及神經功能調節，保護缺血性神經元免受損傷并促進大腦可塑性，發揮神經保護和神經營養作用[11-12]。予以大腦中動脈梗塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)大鼠側腦室注射miR-377抑制劑或腹腔注射依達拉奉，可顯著上調缺血半暗帶區VEGF表達，保護半暗帶區毛細血管內皮細胞，促進血管生成，從而減輕缺血性腦損傷[13-14]。此外，電針刺激肝俞穴和腎俞穴可促進MCAO大鼠缺血半暗帶區VEGF和血小板-內皮細胞黏附分子蛋白表達，改善神經功能缺損[15]。VEGF還可以減少神經元凋亡，提高細胞存活率，減少腦梗死體積，從而減輕腦缺血損傷[16]。

為了探究CHR長期拮抗腦缺血再灌注損傷的作用機制，本項研究應用小鼠制作MCAO再灌注模型，觀察CHR對實驗小鼠腦缺血再灌注后14 d缺血半暗帶區HIF-1α及VEGF表達水平的影響，從而進一步探討CHR對腦損傷的保護機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設備

麻醉機(Harvard Apparatus公司，美國)、手術顯微鏡(Carl Zeiss公司，德國)、雙極電凝器(ACC100,北京德威醫療器械有限公司)、反饋式溫度調節儀(CMA 150, Carnegie Medicin公司，瑞典)、冰凍切片機(Thermo Fisher Scientific公司，美國)、熒光顯微鏡(Nikon公司，日本)。

1.2 試劑

恩氟烷(河北一品制藥有限公司)；CHR(中國食品藥品檢定研究院)；Tween 80(Sigma公司，美國)；HIF-1α抗體(Novus公司，美國)；VEGF抗體(Santa Cruz公司，美國)；NeuN抗體(Millipore公司，美國)等。

1.3 實驗動物及分組

18只健康雄性2月齡C57BL小鼠，體質量(23.5±1) g，實驗動物許可證號：SCXK(京) 2012-0001(北京維通利華實驗動物公司)，飼養于SPF級動物實驗室。采用數字表法隨機將小鼠分為3組：假手術(Sham)組、MCAO組、CHR組。CHR溶于含1%(體積分數)Tween 80和1%(體積分數)DMSO的0.9%(質量分數)氯化鈉注射液(以下簡稱生理鹽水)中，自造模當天開始，CHR組小鼠按0.1 mg/kg[2]腹腔注射CHR，Sham組和MCAO組小鼠腹腔注射同等體積的含1%(體積分數)Tween 80和1%(體積分數)DMSO的生理鹽水，每日1次，直至再灌注后14 d。

1.4 動物模型制作

按照改良的ZeaLonga法[8]制備MCAO模型。首先將恩氟烷混合于70%(體積分數)N2O和30%(體積分數)O2中，用5%(體積分數)恩氟烷進行誘導麻醉，再用2%(體積分數)恩氟烷予以維持麻醉。于小鼠頸部的正中線做一縱行切口，分離右側的頸總動脈、頸內動脈及頸外動脈，將頭端直徑為0.38 mm的尼龍線栓自頸外動脈殘端插入頸內動脈，直至頸外動脈和頸內動脈分叉約1 cm處。手術過程中使用反饋式溫度調節儀監測實驗小鼠肛溫，維持肛溫在(37.0±0.5) ℃范圍。經缺血45 min后，小心地將線栓拔出進行缺血后再灌注。術后小鼠仍飼養于SPF級動物實驗室，自由進食飲水。

1.5 免疫熒光雙標染色

于再灌注后14 d，各組小鼠經腹腔注射水合氯醛麻醉后，快速斷頭取腦，先后于4%(質量分數)多聚甲醛后固定48 h、30%(質量分數)蔗糖脫水24 h，將腦組織按照每片20 μm的厚度進行連續冰凍切片，切片經PBS洗后，用含0.2%(體積分數)TritonX-100的PBS孵育10 min，再經PBS洗后，于室溫下用5%(體積分數)山羊血清封閉30 min，滴加一抗(HIF-1α與NeuN抗體1∶300稀釋或VEGF與NeuN抗體1∶300稀釋)，4 ℃孵育過夜。次日取出切片，經PBS洗后，滴加熒光二抗(1∶300)，避光于室溫下孵育1 h。經PBS洗后，最后用含DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)的封片劑進行封片。于熒光顯微鏡下觀察小鼠腦皮質的缺血半暗帶區。在相同的放大倍數及參數下，每張腦組織冰凍切片隨機選取4個視野照相，使用NIS Element軟件統計HIF-1α和VEGF的陽性細胞數目。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 CHR抑制MCAO小鼠腦缺血半暗帶區HIF-1α表達

免疫熒光標記結果可見，Sham組小鼠腦組織內偶見HIF-1α紅色熒光染色，MCAO組小鼠腦缺血半暗帶區內有大量的HIF-1α紅色熒光染色陽性細胞，CHR組小鼠腦缺血半暗帶區HIF-1α陽性細胞數目比MCAO組明顯減少(圖1A)，3組間HIF-1α陽性細胞數量差異有統計學意義(P<0.05)。兩兩比較結果顯示，MCAO組HIF-1α陰性細胞數量較Sham組明顯增多，CHR組較MCAO組明顯減少，差異具有統計學意義(P<0.05)(圖1B)。

圖1 免疫熒光雙標染色法檢測腦缺血再灌注后14 d Sham、MCAO與CHR組小鼠腦缺血半暗帶區HIF-1α與NeuN的表達Fig.1 Double labeling immunofluorescent images of HIF-1α and NeuN in cerebral ischemia penumbra of Sham, MCAO and CHR groups 14 d after reperfusion A: Representative double immunofluorescence labeling images of HIF-1α (red)/NeuN (green) on 14 d after ischemia/reperfusion. Scale bar=20 μm. B: Quantification of HIF-1α-positive cells. (n=5, mean±SD) *P<0.05 vs Sham group, #P<0.05 vs MCAO group; MCAO: middle cerebral artery occlusion; CHR: chrysophanol; HIF-1α: hypoxia inducible factor-α; DAPI: 4′,6-diamidino-2-phenylindole.

2.2 CHR促進MCAO小鼠腦缺血半暗帶區VEGF表達

免疫熒光標記結果顯示，Sham組小鼠腦組織內可見大量的VEGF紅色熒光染色陽性細胞，MCAO組小鼠腦缺血半暗帶區VEGF陽性細胞數量明顯減少，CHR組小鼠腦缺血半暗帶區VEGF陽性細胞數目比MCAO組明顯增加(圖2A)，3組間VEGF陽性細胞數量比較差異有統計學意義(P<0.05)。兩兩比較結果顯示，MCAO組VEGF陽性細胞數量較Sham組明顯減少，CHR組較MCAO組明顯增加，差異具有統計學意義(P<0.05)(圖2B)。

圖2 免疫熒光雙標染色法檢測腦缺血再灌注后14 d Sham、MCAO與CHR組小鼠腦缺血半暗帶區VEGF與NeuN的表達Fig.2 Double labeling immunofluorescent images of VEGF and NeuN in cerebral ischemia penumbra of Sham,MCAO and CHR groups 14 d after reperfusion A: Representative double labeling immunofluorescent of VEGF (red)/NeuN (green) on 14 d after ischemia/reperfusion. Scale bar=20 μm. B: Quantification of VEGF-positive cells. (n = 5, mean±SD) *P<0.05 vs Sham group, #P<0.05 vs MCAO group; MCAO: middle cerebral artery occlusion; CHR: chrysophanol; VEGF: vascular endothelial growth factor; DAPI: 4′,6-diamidino-2-phenylindole.

2.3 小鼠腦缺血半暗帶區HIF-1α、VEGF分別與NeuN共定位

在MCAO小鼠腦缺血半暗帶區內可見HIF-1α陽性細胞及NeuN陽性細胞，其中HIF-1α陽性細胞為紅色熒光，NeuN陽性細胞為綠色熒光，細胞核為藍色熒光(圖1A)。圖像合并后，紅色與綠色熒光能夠重合，表明HIF-1α與神經元共定位，即腦缺血再灌注后在缺血半暗帶區神經元內有HIF-1α表達。

在CHR組小鼠腦缺血半暗帶區內可見VEGF陽性細胞及NeuN陽性細胞，其中VEGF陽性細胞為紅色熒光，NeuN陽性細胞為綠色熒光，細胞核為藍色熒光(圖2A)，圖像合并后，紅色與綠色熒光重合，表明VEGF與神經元共定位，即CHR促進腦缺血小鼠腦神經元內VEGF的表達。

3 討論

缺血性卒中是一種常見的腦血管疾病，發病率高，是世界范圍內嚴重致殘和致死的主要原因之一[17]，目前臨床上對腦缺血再灌注損傷的治療存在各種局限性，用于治療腦缺血的藥物仍不足以顯著改善患者預后。因此，有必要為腦缺血再灌注損傷尋找有效的治療方法。有研究者[18]發現，術前30 min給予大黃酚能改善再灌注24 h大鼠的神經功能評分，減少腦梗死體積。但是CHR在腦缺血再灌注損傷中發揮長期神經保護作用的研究尚少。本課題組前期的研究[3]表明，腦缺血再灌注后14 d，CHR能保護MCAO小鼠的腦缺血損傷，改善腦缺血再灌注小鼠的預后，提示CHR對腦缺血再灌注損傷具有長期的神經保護作用。本團隊前期還發現，CHR能減輕內質網應激、下調炎性因子表達[2-3]，并有抑制氧化應激、減少自噬反應的作用[19-20]。然而CHR在腦缺血再灌注損傷中發揮長期神經保護作用的機制目前尚不完全清楚。因此，本研究應用免疫熒光染色法觀察MCAO小鼠腦缺血再灌注后14 d缺血半暗帶區HIF-1α及VEGF蛋白的表達水平，從而進一步探究CHR發揮長期腦保護作用的機制。

HIF-1α受氧濃度的密切調控。在常氧下，HIF-1α被脯氨酰羥化酶泛素化并降解。在缺氧條件下，HIF-1α與HIF-1β形成二聚體，并激活靶基因的轉錄。缺氧是缺血性卒中的主要特征。文獻[21]報道，HIF-1α的異常表達參與缺血缺氧性疾病的發展過程，腦出血大鼠血清中的HIF-1α水平顯著高于正常大鼠。此外，處于高原地區的缺血性腦卒中患者的血清中HIF-1α表達水平明顯升高，其表達水平與腦梗死面積大小、腦損傷程度及預后有關[22]。本研究通過免疫熒光染色法觀察到在Sham組小鼠的腦組織內中HIF-1α的表達極低，然而MCAO組小鼠腦缺血半暗帶區的HIF-1α表達水平明顯增多，提示腦缺血再灌注損傷引起HIF-1α表達增加，促進缺血性腦損傷。有文獻[23]報道，大黃可以通過下調HIF-1α的水平，降低缺氧/復氧處理后腸上皮細胞的炎癥反應，保護腸上皮細胞。本研究的熒光染色結果顯示，給予CHR治療14天的腦缺血再灌注小鼠缺血半暗帶區內HIF-1α蛋白表達水平比MCAO組小鼠顯著減少，且HIF-1α與NeuN共定位，提示CHR能抑制腦缺血再灌注損傷后神經元內HIF-1α的產生。筆者前期研究[3]證明，CHR能顯著降低MCAO小鼠神經元內TUNEL陽性細胞數量。結合本研究結果，進一步提示CHR很可能通過抑制腦缺血再灌注損傷后神經元內HIF-1α的產生，減少神經元的凋亡，發揮神經保護作用。

VEGF參與腦缺血損傷后的能量代謝、血管生成、凋亡和遷移等一系列神經損傷修復過程。研究[24]表明，VEGF可降低神經元對傷害性刺激的反應強度，提高細胞對缺血缺氧損傷的耐受性，進而減少損傷細胞的死亡，并促進神經元生長和發育，發揮細胞保護效應。本研究的免疫熒光染色結果顯示，MCAO組小鼠腦缺血半暗帶區的VEGF表達水平比Sham組明顯減少，提示VEGF的減少可能是造成腦缺血損傷的主要原因之一。研究[25]顯示，缺血預處理能夠誘導VEGF及其受體的大量表達，對缺血性腦損傷具有保護作用。給腦梗死大鼠注射VEGF能明顯促進缺血后損傷神經元的修復[26]，顯著減少梗死體積[16]，表明VEGF可改善腦缺血損傷。為了進一步明確CHR拮抗腦缺血再灌注損傷的機制，筆者觀察了小鼠腦內VEGF在神經元中的表達。本研究結果表明，給予CHR治療的腦缺血再灌注小鼠，于再灌注14 d后，其腦缺血半暗帶區的VEGF水平比MCAO組小鼠明顯增多，且VEGF與NeuN免疫熒光共定位，提示CHR可能通過上調神經元內VEGF表達水平進而發揮長期的神經保護作用。

綜上，本研究結果提示，CHR可能通過下調腦缺血再灌注損傷后缺血半暗帶區HIF-1α的水平、上調VEGF表達，保護缺血性神經元，從而發揮長期的神經保護作用。本研究進一步豐富了CHR改善腦缺血再灌注損傷的預后、發揮長期腦保護作用的相關機制，為臨床應用CHR治療缺血性腦血管病提供了更多依據。