遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠缺血半暗帶區(qū)PERK/p-eIF2α通路及自噬的影響

楊 楠 丁 錨 閆 峰 師文娟 黃語(yǔ)悠 趙詠梅

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 北京市老年病醫(yī)療研究中心 神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 腦血管病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053)

缺血性卒中占全部腦卒中的79%，具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率的特點(diǎn)，是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，除在有限的時(shí)間窗內(nèi)應(yīng)用重組組織型纖溶酶原激活劑進(jìn)行溶栓外，缺少有效的治療和預(yù)防方法[1]。遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)(remote ischemic preconditioning, RIPC)是指通過(guò)對(duì)非重要器官的重復(fù)缺血/缺氧，顯著增強(qiáng)其他遠(yuǎn)隔的靶器官或組織對(duì)缺血/缺氧的耐受能力。RIPC不直接作用于靶器官，而是在其他非重要器官進(jìn)行，避免了對(duì)重要器官(如腦和心臟)直接進(jìn)行預(yù)適應(yīng)可能引起的缺血風(fēng)險(xiǎn)。本課題組以往的研究[2-3]表明，RIPC對(duì)腦缺血再灌注損傷有神經(jīng)保護(hù)作用，但相關(guān)作用機(jī)制尚不完全清楚。

自噬是真核生物中重要的胞內(nèi)降解機(jī)制，在缺乏營(yíng)養(yǎng)的生長(zhǎng)環(huán)境或應(yīng)激刺激下，細(xì)胞啟動(dòng)自噬。研究[4]顯示，在腦缺血中自噬是一把雙刃劍，既可加重腦缺血損傷，也可防治腦缺血[4]。輕度或中度的自噬激活能促進(jìn)細(xì)胞生存，而過(guò)度的自噬激活則促進(jìn)細(xì)胞死亡。Beclin1和LC3B均為自噬相關(guān)基因，參與了自噬體的形成[5]。本課題組前期研究[6]結(jié)果均表明，腦缺血再灌注損傷后，腦內(nèi)Beclin1和LC3B的表達(dá)增高，說(shuō)明腦缺血可導(dǎo)致自噬水平升高。應(yīng)用自噬抑制劑3-MA可顯著下調(diào)大鼠缺血區(qū)的自噬相關(guān)蛋白LC3水平，縮小腦梗死體積，減輕腦損傷，說(shuō)明抑制自噬過(guò)度激活可保護(hù)腦缺血再灌注損傷[7]。

有研究[8]表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)對(duì)自噬有調(diào)控作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)是蛋白質(zhì)合成的重要場(chǎng)所，在細(xì)胞代謝和各種病理過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。ER內(nèi)環(huán)境平衡的破壞會(huì)導(dǎo)致ERS。ERS發(fā)生時(shí)，激活eIF2α的激酶蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)與ER分子伴侶GRP78發(fā)生解離，GRP78與ER內(nèi)大量的未折疊蛋白結(jié)合，以協(xié)助其正確折疊，這一過(guò)程會(huì)觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)[9]。UPR的激活導(dǎo)致ER伴侶蛋白水平升高，激活包括PERK/eIF2α 等信號(hào)通路[10]。ERS可以通過(guò)PERK/eIF2α信號(hào)通路激活自噬[8]。在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中，敲除PERK/eIF2α基因可抑制ERS誘導(dǎo)的自噬，說(shuō)明PERK/eIF2α信號(hào)通路對(duì)于ERS誘導(dǎo)的自噬是必需的[11]。

研究[12]顯示，心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用是通過(guò)抑制自噬完成的，提示在腦以外的重要器官中抑制自噬過(guò)度激活可能是缺血再灌注損傷的潛在保護(hù)機(jī)制。但是，自噬是否參與RIPC的腦保護(hù)作用尚不清楚。因此，本研究采用后肢RIPC方法對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈梗塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)再灌注大鼠進(jìn)行保護(hù)，觀察腦缺血大鼠再灌注24 h后自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3B以及ER分子伴侶GRP78和ERS相關(guān)蛋白p-eIF2α的表達(dá)，從而研究RIPC保護(hù)大鼠局灶性腦缺血損傷過(guò)程中PERK/p-eIF2α通路及自噬水平的變化，探討RIPC保護(hù)腦缺血損傷的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

小動(dòng)物呼吸機(jī)和麻醉機(jī)(Harvard Apparatus公司,美國(guó))、手術(shù)顯微鏡(Carl Zeiss公司,德國(guó))、反饋式溫度調(diào)節(jié)儀(CMA 150, Carnegie Medicin公司,瑞典)、雙極電凝器(ACC100,北京德威醫(yī)療器械有限公司)、冰凍切片機(jī)(Thermo Fisher Scientific公司,美國(guó))、熒光顯微鏡(Nikon公司,日本)。恩氟烷和水合氯醛購(gòu)自河北一品制藥公司，Beclin1、LC3B、GRP78、p-eIF2α、NeuN抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量280～320 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。24只SD大鼠采用抽簽法隨機(jī)分為3組：假手術(shù)(Sham)組、MCAO組、RIPC+MCAO組，每組8只大鼠。飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物室，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.3 動(dòng)物模型制作

1)RIPC[2]：RIPC+MCAO組進(jìn)行RIPC。首先分離大鼠雙側(cè)股動(dòng)脈，動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)股動(dòng)脈10 min，之后松開(kāi)動(dòng)脈夾，再灌注10 min，構(gòu)成一個(gè)循環(huán)，每天連續(xù)進(jìn)行3個(gè)循環(huán)，連續(xù)進(jìn)行3d。其余兩組大鼠只切開(kāi)皮膚后縫合。

2)MCAO模型制作：MCAO大鼠模型的制備依照改良Zea Longa法[13]。先在70%(體積分?jǐn)?shù))N2O和30%(體積分?jǐn)?shù))O2中混合5%(體積分?jǐn)?shù))恩氟烷誘導(dǎo)麻醉，后改用2%(體積分?jǐn)?shù))恩氟烷維持麻醉。大鼠經(jīng)頸部作正中切口，切開(kāi)皮膚和皮下組織，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈并夾閉，頸外動(dòng)脈凝斷后，將尼龍線栓自頸外動(dòng)脈殘端插進(jìn)頸內(nèi)動(dòng)脈，至線栓頂端到達(dá)距頸總動(dòng)脈分叉約1.8～2.0 cm有阻力感處停止。缺血90 min 后，拔出線栓進(jìn)行再灌注。逐層縫合肌肉、皮膚，再次消毒。術(shù)中監(jiān)測(cè)大鼠各項(xiàng)生理參數(shù)在正常范圍。手術(shù)成功后的大鼠提尾懸空時(shí)身體向正常側(cè)彎曲[14]，模型制作失敗后隨即補(bǔ)充。

1.4 免疫熒光雙標(biāo)染色

各組大鼠于再灌注后24 h用水合氯醛腹腔注射麻醉，快速斷頭取腦，行腦組織連續(xù)冰凍切片(厚度約為20 μm)，-80 ℃保存。取Sham組、MCAO組以及RIPC+MCAO組大鼠腦組織冰凍切片，于預(yù)冷的4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛中固定10 min后，用0.2%(體積分?jǐn)?shù))TritonX-100破膜10 min，之后滴加5%(體積分?jǐn)?shù))的山羊血清室溫封閉30 min，棄血清，之后分別滴加Beclin1與NeuN抗體(Beclin1抗體1∶200稀釋?zhuān)琋euN抗體1∶300稀釋)、GRP78與Beclin1抗體(均1∶200稀釋)、GRP78與LC3B抗體(均1∶200稀釋)，或Beclin1與p-eIF2α抗體(均1∶200稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜。陰性對(duì)照不加一抗，用PBS替代。次日將切片用PBS洗后，滴加熒光二抗(1∶300稀釋)，室溫避光孵育1 h。PBS漂洗后，用含DAPI的封片劑封片。將封片后的切片置于熒光顯微鏡下觀察大鼠腦皮質(zhì)的缺血半暗帶區(qū)[15]。在相同的放大倍數(shù)及參數(shù)下，每張腦組織冰凍切片隨機(jī)選取4個(gè)視野照相，使用NIS Element軟件統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 RIPC抑制MCAO大鼠缺血半暗帶區(qū)Beclin1的表達(dá)

免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果顯示，在 MCAO大鼠腦缺血半暗帶區(qū)內(nèi)可見(jiàn)Beclin1陽(yáng)性細(xì)胞及NeuN陽(yáng)性細(xì)胞，其中 Beclin1陽(yáng)性細(xì)胞為綠色熒光，NeuN陽(yáng)性細(xì)胞為紅色熒光，所有細(xì)胞的胞核為藍(lán)色熒光。圖像合并后，綠色與紅色熒光重合，表明Beclin1與神經(jīng)元共定位(圖1A)，即腦缺血再灌注后Beclin1在大鼠缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)。

Sham組沒(méi)有缺血半暗帶區(qū)，其與缺血半暗帶相對(duì)應(yīng)的腦區(qū)內(nèi)偶見(jiàn)Beclin1綠色熒光陽(yáng)性細(xì)胞，MCAO組大鼠再灌注24 h，缺血半暗帶區(qū)可見(jiàn)大量Beclin1綠色熒光陽(yáng)性細(xì)胞，RIPC+MCAO組大鼠缺血半暗帶區(qū)Beclin1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較MCAO組明顯減少(圖1A)，三組間Beclin1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，MCAO組Beclin1陽(yáng)性細(xì)胞較Sham組明顯增高(P<0.05)，RIPC+MCAO組Beclin1陽(yáng)性細(xì)胞較MCAO組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1B)。

圖1 免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測(cè)腦缺血再灌注后24 h Sham、MCAO與RIPC+MCAO組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)Beclin1與NeuN的表達(dá) Fig.1 Expression of Beclin1 and NeuN in cerebral ischemic penumbra of Sham, MCAO and RIPC+MCAO groups after 24 h reperfusion which was examined with immunofluorescence double stainingA: A representative double immunofluorescence staining showed the colocalization of Beclin1 (green) and NeuN (red) in the ischemic penumbra of MCAO rats. Scale bar=20 μm. B: quantification of Beclin1 positive cell. Data are means±SD (n=5). *P<0.05 vs Sham group, #P<0.05 vs MCAO group; MCAO: middle cerebral artery occlusion; RIPC: remote ischemic preconditioning; DAPI: 4′,6-diamidino-2-phenylindole

2.2 MCAO大鼠缺血半暗帶區(qū)GRP78分別與Beclin1和LC3B共定位

免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果顯示，MCAO組大鼠再灌注24 h腦缺血側(cè)半暗帶區(qū)內(nèi)，GRP78陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色，Beclin1和LC3B陽(yáng)性細(xì)胞均呈紅色，胞核呈藍(lán)色。合并圖像發(fā)現(xiàn)，綠色熒光與紅色熒光重合，表明GRP78分別與Beclin1和LC3B共定位，提示在缺血再灌注后，自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3B表達(dá)的上調(diào)與ER分子伴侶GRP78相關(guān)(圖2)。

圖2 腦缺血大鼠再灌注24 h后半暗帶區(qū)GRP78分別與Beclin1和LC3B 共定位Fig.2 GRP78 was colocalized with Beclin1 and LC3B respectively, which was examined with immunofluorescence staining in the ischemic penumbra of MCAO group rats after 24 h reperfusionA representative double immunofluorescence staining showed the colocalization of GRP78(green)with Beclin1(red) and LC3B(red) respectively in the ischemic penumbra of MCAO rats. Scale bar=20 μm. MCAO: middle cerebral artery occlusion; DAPI: 4′,6-diamidino-2-phenylindole.

2.3 MCAO大鼠缺血半暗帶區(qū)Beclin1與p-eIF2α共定位，且RIPC抑制MCAO大鼠缺血半暗帶區(qū)Beclin1和p-eIF2α雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)

通過(guò)免疫熒光雙標(biāo)染色可見(jiàn)，MCAO組大鼠再灌注24 h缺血側(cè)半暗帶區(qū)內(nèi)，呈紅色熒光的陽(yáng)性細(xì)胞是Beclin1，呈綠色熒光的陽(yáng)性細(xì)胞是p-eIF2α，藍(lán)色標(biāo)記的是細(xì)胞核。合并圖像發(fā)現(xiàn)，綠色熒光與紅色熒光重合，表明Beclin1與p-eIF2α共定位(圖3A)，提示在腦缺血再灌注后，自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達(dá)上調(diào)與ERS相關(guān)蛋白p-eIF2α相關(guān)。

Sham組大鼠沒(méi)有缺血半暗帶區(qū)，其與缺血半暗帶相對(duì)應(yīng)的腦區(qū)內(nèi)未見(jiàn)Beclin1和p-eIF2α雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞。而MCAO組、RIPC+MCAO組大鼠缺血半暗帶區(qū)可見(jiàn)Beclin1和p-eIF2α雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞(圖3A)，三組間Beclin1和p-eIF2α雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，MCAO組Beclin1和p-eIF2α雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞較Sham組明顯增高(P<0.05)，RIPC+MCAO組Beclin1和p-eIF2α雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞較MCAO組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3B)。

圖3 免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測(cè)腦缺血再灌注后24 h Sham、MCAO與RIPC+MCAO組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)Beclin1與p-eIF2α的表達(dá)Fig.3 Expression of Beclin1 and p-eIF2α in cerebral ischemic penumbra of Sham, MCAO and RIPC+MCAO groups rats after 24 h reperfusion which was examined with immunofluorescence double stainingA: A representative double immunofluorescence staining showed the colocalization of Beclin1 (red) and p-eIF2α (green) in the ischemic penumbra of MCAO rats. Scale bar=20 μm. B: quantification of Beclin1 and p-eIF2α double positive cells. Data are means±SD (n=5). *P<0.05 vs Sham group, #P<0.05 vs MCAO group; MCAO: middle cerebral artery occlusion; RIPC: remote ischemic preconditioning; DAPI: 4′,6-diamidino-2-phenylindole.

3 討論

缺血適應(yīng)作為腦缺血損傷的有效保護(hù)策略，近年來(lái)引起人們的廣泛關(guān)注,在機(jī)體重要器官進(jìn)行缺血預(yù)適應(yīng)難度較大，且易形成致死性缺血，故不宜被臨床采用。本課題組前期研究[16]顯示，采用遠(yuǎn)端肢體進(jìn)行缺血預(yù)適應(yīng)，對(duì)腦或其他重要器官也同樣具有保護(hù)作用，且更適合向臨床轉(zhuǎn)化。因此，深入研究 RIPC對(duì)腦缺血的保護(hù)作用并探討其相關(guān)機(jī)制，對(duì)臨床應(yīng)用RIPC治療缺血性腦血管病具有重要意義。本文旨在探究RIPC對(duì)局灶性腦缺血損傷大鼠再灌注后24 h缺血半暗帶區(qū)自噬水平的影響，以及RIPC是否通過(guò)抑制PERK/p-eIF2α通路，從而避免自噬過(guò)度激活，產(chǎn)生腦保護(hù)作用，進(jìn)一步明確RIPC發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的具體機(jī)制。

自噬是機(jī)體的一種防御性反應(yīng)，適度自噬具有維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和促進(jìn)細(xì)胞生存的作用，但自噬的過(guò)度激活則可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Beclin1在自噬的起始階段具有重要作用，并且能夠促進(jìn)LC3的形成以啟動(dòng)自噬[17]。研究[18]表明，在大腦缺血再灌注幾小時(shí)后，自噬相關(guān)蛋白表達(dá)就開(kāi)始上升。為了探究RIPC對(duì)腦缺血再灌注后自噬的影響，本研究檢測(cè)了RIPC對(duì)各組大鼠缺血側(cè)腦組織自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達(dá)。研究結(jié)果顯示，與Sham組相比，MCAO組大鼠腦缺血再灌注后24 h缺血側(cè)腦組織自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達(dá)水平明顯升高，表明腦缺血再灌注誘導(dǎo)Beclin1過(guò)量產(chǎn)生，自噬被過(guò)度激活。通過(guò)將Beclin1與NeuN進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色發(fā)現(xiàn)，自噬相關(guān)蛋白Beclin1與神經(jīng)元共定位，說(shuō)明缺血再灌注后Beclin1在缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)增多，提示此時(shí)神經(jīng)元發(fā)生過(guò)度自噬，這可能是造成腦缺血神經(jīng)元損傷的主要原因之一。本課題組前期的研究[16]結(jié)果表明，給予RIPC處理的MCAO大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低，腦梗死體積明顯減小。而本研究結(jié)果顯示，予以RIPC的MCAO大鼠腦缺血半暗帶區(qū)自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達(dá)水平明顯下降。因此，RIPC對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用很可能是通過(guò)減少Beclin1產(chǎn)生，進(jìn)而抑制神經(jīng)元過(guò)度自噬實(shí)現(xiàn)的。有研究[19]報(bào)道，聯(lián)合應(yīng)用RIPC和缺血后適應(yīng)可通過(guò)抑制自噬保護(hù)腦缺血大鼠，而本研究則證明單獨(dú)應(yīng)用RIPC可通過(guò)抑制神經(jīng)元自噬，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

LC3作為自噬體形成的標(biāo)志，與自噬空泡形成的數(shù)量有關(guān)，代表自噬的活性程度。LC3有3種不同的亞型(LC3A、LC3B、LC3C)，通常檢測(cè)組織中LC3B蛋白的含量代表組織內(nèi)LC3的表達(dá)量[20]。最近研究[21]顯示，ER分子伴侶GRP78的表達(dá)上調(diào)可以激活自噬，而GRP78的缺失可抑制ERS誘導(dǎo)的自噬激活，說(shuō)明GRP78很可能是ERS和自噬激活中的橋梁蛋白。本研究選取缺血再灌注24 h大鼠腦組織進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色，結(jié)果顯示，GRP78分別與自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3B共定位，提示在缺血再灌注后自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3B的產(chǎn)生與ERS有關(guān)，ER分子伴侶GRP78的產(chǎn)生很可能誘導(dǎo)自噬過(guò)度激活。

ERS導(dǎo)致的UPR反應(yīng)可激活PERK/eIF2α信號(hào)通路，進(jìn)而引起自噬激活[10]。文獻(xiàn)[11]報(bào)道，依賴PERK的eIF2α磷酸化可誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞自噬，敲除PERK/eIF2α基因可抑制ERS誘導(dǎo)的自噬。本研究結(jié)果顯示，ERS相關(guān)蛋白p-eIF2α可與自噬相關(guān)蛋白Beclin1共定位，提示在腦缺血再灌注后自噬的過(guò)度激活與ERS相關(guān)蛋白p-eIF2α有關(guān)，該結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明腦缺血再灌注后自噬的過(guò)度激活與ERS相關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，腦缺血再灌注24 h后p-eIF2α和Beclin1雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較Sham組明顯增多，說(shuō)明腦缺血再灌注24 h后，ERS很可能通過(guò)激活PERK/eIF2α通路，導(dǎo)致自噬過(guò)度激活。給予RIPC處理的大鼠腦組織中p-eIF2α和Beclin1雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較MCAO組大鼠明顯下降，提示在腦缺血再灌注后，RIPC可能通過(guò)減少ERS的產(chǎn)生，從而抑制自噬過(guò)度激活，減少神經(jīng)元自噬性死亡，發(fā)揮對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，RIPC很可能通過(guò)抑制ERS，使神經(jīng)元中的自噬相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而抑制腦缺血再灌注自噬的過(guò)度激活，從而減少神經(jīng)元死亡，發(fā)揮腦保護(hù)作用。目前有關(guān)RIPC通過(guò)抑制ERS調(diào)控自噬發(fā)揮腦保護(hù)作用的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究為深入研究RIPC的相關(guān)機(jī)制提供了新證據(jù)，對(duì)臨床應(yīng)用RIPC治療缺血性腦病有一定的理論指導(dǎo)意義。