eIF5A-2下調(diào)對人肺癌細胞株A549/DDP耐藥及自噬的影響*

李星 劉東升 杜鋼

(巴彥淖爾市醫(yī)院放療科，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000)

肺癌是最常見的一種惡性腫瘤，男性發(fā)病率較高，是導(dǎo)致癌癥死亡的主要原因之一[1-2]。隨著肺癌發(fā)病率日益升高，其已經(jīng)從一種罕見的疾病轉(zhuǎn)變?yōu)槿蛐怨残l(wèi)生問題[3-4]。肺癌主要分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌[5]，其治療主要是通過手術(shù)、放療、化療，其中以順鉑為代表的鉑類抗腫瘤藥是治療非小細胞肺癌的一線化療藥[6-7]，順鉑可引起腫瘤細胞DNA損傷從而介導(dǎo)多種細胞信號通路抑制細胞增殖、促進細胞凋亡[8]。但順鉑的耐藥現(xiàn)象逐漸加劇[9]，給臨床治療帶來困難。目前對順鉑耐藥的機制尚不明確。因此，探討順鉑耐藥的機制對肺癌的治療具有重要影響。近年研究發(fā)現(xiàn)，真核翻譯起始因子5A-2(Eukaryotic Translation Initiation Factor 5A-2，eIF5A-2)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，在腫瘤細胞內(nèi)eIF5A-2高表達并可促進腫瘤細胞的增殖、凋亡等過程[10]，但eIF5A-2對肺癌細胞耐藥性的影響鮮有報道。本研究采用小干擾RNA(Small Intemring RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染人肺癌A549/DDP細胞，探討抑制eIF5A2對A549/DDP細胞耐藥性的影響并分析其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑 人肺癌細胞株A549/DDP(貨號ZQ0461)購自上海中喬新舟生物科技有限公司；引物、eIF5A-2-siRNA慢病毒均由上海吉凱基因生物公司設(shè)計合成；實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)試劑盒(貨號14966005)均購自美國ThermoFisher公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號K1622)購自美國Fermentas公司；Trizol(貨號46301)購自美國Sigma公司；兔抗人單克隆eIF5A2抗體(貨號ab150439)、兔抗人多克隆LC3 Ⅱ抗體(貨號ab51520)、兔抗人單克隆Beclin-1抗體(貨號ab207612)購自美國Abcam公司。

1.2 儀器 酶標儀(型號SpectraMax iD3)購自上海美谷分子儀器有限公司；電泳儀(型號1658001)購自美國Bio-Rad公司；實時熒光定量PCR儀(型號ABI9700)購自美國ABI公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 人肺癌A549和A549/DDP細胞接種于RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含1%雙抗，10% FBS)，置于37 ℃，0.5%的CO2孵育箱中培養(yǎng)，待細胞融合至80%時，棄培養(yǎng)基，加入含500 ng/mL DDP藥物的培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱，2～3 d換液，待細胞長滿消化傳代，進入對數(shù)生長期時收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.3.2 慢病毒轉(zhuǎn)染及細胞分組 取1.3.1細胞接種于以2×105個/孔接種于24孔板，細胞融合至60%時轉(zhuǎn)染，按照慢病毒轉(zhuǎn)染說明書操作，實驗分為4組：正常對照組(人肺癌細胞A549)，空白對照組(人肺癌細胞A549/DDP)：不采用病毒轉(zhuǎn)染，陰性對照(Negative Control，NC)組：采用LV-NC-GFP轉(zhuǎn)染A549/DDP細胞，eIF5A-2 SiRNA(SiRNA)組：采用LV-eIF5A-2-SiRNA-GFP轉(zhuǎn)染A549/DDP細胞。轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，置于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。培養(yǎng)72 h后，收集細胞，進行后續(xù)實驗。

1.3.3 qRT-PCR檢測各組細胞eIF5A-2 mRNA相對表達水平 Trizol提取1.3.2中各組細胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對RNA合成cDNA，按照實時熒光定量PCR試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件95 ℃預(yù)變性15 min、95 ℃變性10 s、56 ℃退火20 s、72 ℃延伸50 s，40個循環(huán)，以GAPDH為對照，采用2-△△Ct法分析eIF5A-2 mRNA相對表達水平。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 MTT檢測DDP作用下A549/DDP細胞的耐藥性 1.3.2中細胞以2×104個/孔接種于96孔板24 h后加入終濃度為8 μg/mL DDP，每組設(shè)8個復(fù)孔，設(shè)置調(diào)零孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μL濃度5 mg/mL的MTT溶液，培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔加入150 μL DMSO放于搖床震蕩10 min，待結(jié)晶完全溶解后在酶標儀檢測570 nm處各孔的OD值。計算各組細胞半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.3.5 流式細胞術(shù)檢測A549/DDP細胞凋亡率 細胞轉(zhuǎn)染72 h后，每組加入終濃度為8 μg/mL DDP，48 h后收集細胞，按照Annex-in V-FITC凋亡試劑盒方法在流式細胞儀上檢測每組細胞的凋亡率。

1.3.6 單酰戊二胺(MDC)染色檢測細胞中自噬小體形成情況 1.3.2中細胞轉(zhuǎn)染72 h，常規(guī)消化離心，收集各組細胞用1×清洗緩沖液清洗細胞棄上清，重懸細胞并調(diào)整每組細胞至1×106個/mL。取細胞懸液加至新EP管中，加入MDC染液，輕輕混勻，避光孵育30～40 min，用1×沖洗緩沖液清洗細胞2～3次，棄上清，收集細胞，加入抗熒光淬滅封片劑，熒光顯微鏡下觀察細胞中自噬小體的形成，統(tǒng)計自噬小體的數(shù)目。

1.3.7 Western blot法檢測eIF5A-2、LC3Ⅱ及Beclin-1蛋白相對表達水平 收集1.3.2各組細胞，用含PMSF的RIPA裂解液冰水浴下裂解，提取蛋白，BCA法蛋白定量，按照4∶1在蛋白中加5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱3～5 min，置于-20 ℃保存。按照SDS-PAGE凝膠配方表制備12%分離膠和5%濃縮膠，以每泳道30 μg蛋白上樣，蛋白凝膠電泳，根據(jù)蛋白marker切膠，濕法轉(zhuǎn)膜，抗體LC3Ⅱ、Beclin-1、eIF5A-2均按照1∶1000的比例稀釋后與PVDF膜4 ℃孵育過夜，TBST清洗，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫孵育并放搖床2 h，TBST清洗，參考ECL發(fā)光液說明書對條帶孵育、曝光、顯影。通過Image J軟件對條帶灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞eIF5A-2 mRNA表達水平 與正常對照組相比，空白對照組、NC組細胞中eIF5A-2 mRNA相對表達水平顯著升高(P<0.05)；與空白對照組、NC組相比，eIF5A-2 SiRNA組細胞eIF5A-2 mRNA相對表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組細胞中eIF5A-2 mRNA相對表達水平

2.2 eIF5A-2下調(diào)對A549/DDP細胞的耐藥性影響 與正常對照組相比，空白對照組、NC組細胞半數(shù)抑制濃度IC50顯著升高(P<0.05)；與空白對照組、NC組相比，eIF5A-2-SiRNA組細胞半數(shù)抑制濃度IC50顯著降低(P<0.05)，見圖2。

2.3 eIF5A-2下調(diào)對DDP作用下A549/DDP細胞的凋亡的影響 與空白對照組、NC組細胞相比，eIF5A-2-SiRNA組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見圖3～4。

圖2 各組細胞DDP耐藥性

圖3 各組A549/DDP細胞凋亡情況

圖4 各組A549/DDP細胞凋亡率

2.4 eIF5A-2下調(diào)對A549/DDP細胞自噬水平的影響 與空白對照組、NC組細胞相比，eIF5A-2-SiRNA組細胞中自噬小體數(shù)目顯著減少(P<0.05)，見圖5～6。

2.5 eIF5A-2下調(diào)對A549/DDP細胞中eIF5A-2、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達的影響 與空白對照組、NC組細胞相比，eIF5A-2-SiRNA組細胞eIF5A-2、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白相對表達水平顯著降低(均P<0.05)，見圖7～8。

圖5 各組細胞中自噬小體形成情況(200×)

圖6 各組A549/DDP細胞中自噬小體數(shù)目

圖7 Western blot檢測各組A549/DDP細胞中eIF5A-2、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達

圖8 各組A549/DDP細胞eIF5A-2、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白相對表達水平

3 討論

eIF5A2基因位于人類染色體3q26.2區(qū)[11]，其編碼的蛋白在真核生物組織和細胞中大量存在，可促進蛋白質(zhì)的合成，在翻譯蛋白質(zhì)過程發(fā)揮起始和延伸作用。大量研究表明，eIF5A2蛋白在正常組織細胞中低表達，在多種惡性腫瘤細胞中高表達，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中可能作為致癌因子發(fā)揮作用[12-13]。

肺癌的發(fā)病率高，預(yù)后差，對化療順鉑的耐藥性日益升高已經(jīng)成為臨床治療的難題，探討肺癌細胞對順鉑的耐藥性機制具有極其重要的科學(xué)意義[14-15]。因此，本研究以人肺癌A549/DDP細胞株為研究對象檢測發(fā)現(xiàn)，與正常對照組A549細胞相比，空白組、NC組A549/DDP細胞中elF5A2 mRNA相對表達水平明顯升高，提示elF5A2在人肺癌A549/DDP細胞中高表達。近年研究發(fā)現(xiàn)，elF5A2抑制劑GC7與西妥昔單抗聯(lián)用可明顯提高上皮性肝癌細胞對西妥昔單抗的敏感性，提示GC7可能通過抑制elF5A2表達，促進西妥昔單抗對肝癌細胞毒性[16]。Liu等[17]研究表明，RNA干擾沉默eIF5A-2可提高急性髓細胞白血病細胞對柔紅霉素的敏感性。此外，研究發(fā)現(xiàn)敲除eIF5A2基因可逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，調(diào)節(jié)胃癌細胞對DDP的敏感性[18]。本研究通過轉(zhuǎn)染eIF5A-2 SiRNA沉默elF5A2表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組、NC組相比，eIF5A-2-SiRNA組A549/DDP細胞eIF5A-2 mRNA及蛋白相對表達水平顯著降低，提示elF5A2低表達模型建立成功。進一步用不同濃度的DDP干預(yù)耐藥A549/DDP細胞，研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組、NC組相比，eIF5A-2-SiRNA組半數(shù)抑制濃度IC50顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，提示elF5A2下調(diào)可提高人肺癌A549/DDP細胞對DDP的敏感性，促進細胞凋亡。

自噬是細胞處于營養(yǎng)缺乏或外界刺激狀態(tài)下產(chǎn)生的一種自身保護機制，有助于細胞存活，細胞可通過自噬作用降解未折疊蛋白質(zhì)和受損細胞器，消化清除細胞內(nèi)垃圾，維持細胞內(nèi)代謝平衡[19-20]。此外，自噬參與腫瘤發(fā)生發(fā)展、新陳代謝紊亂、神經(jīng)退行性變等病理過程，細胞自噬與腫瘤細胞的耐藥密切相關(guān)[21]。Xiao等[22]研究發(fā)現(xiàn)，抑制熱休克蛋白HSP90AA1可抑制骨肉瘤細胞的自噬保護作用，增加細胞對耐阿霉素、順鉑和甲氨蝶呤藥等化療藥物的耐藥性。TXNDC17過表達可通過促進卵巢癌細胞自噬，從而促進細胞對紫杉醇產(chǎn)生耐藥性[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組、NC組細胞相比，eIF5A-2-SiRNA組A549/DDP細胞中自噬小體數(shù)目顯著減少，提示下調(diào)elF5A2表達可降低人肺癌A549/DDP細胞的自噬水平。自噬微管相關(guān)蛋白LC3Ⅱ和Beclin-1在自噬體形成中起重要作用，LC3Ⅱ位于前自噬泡和自噬泡膜表面，是自噬體形成的重要蛋白，LC3Ⅱ可與p62結(jié)合形成多聚泛素化蛋白-p62復(fù)合物，泛素化蛋白被解降，是檢測自噬活性的標志蛋白之一[24]。Beclin-1作為啟動自噬過程的關(guān)鍵蛋白，可正向調(diào)節(jié)自噬過程[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組、NC組細胞相比，eIF5A-2-SiRNA組A549/DDP細胞中LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白相對表達水平均顯著降低，提示下調(diào)elF5A2表達可降低A549/DDP細胞中LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達。

4 結(jié)論

elF5A2下調(diào)可降低人肺癌細胞株A549/DDP耐藥性，可能與下調(diào)LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達，降低細胞的自噬水平有關(guān)。elF5A2可能成為逆轉(zhuǎn)肺癌化療耐藥的一個新靶點，為臨床治療肺癌對順鉑的耐藥性提供參考據(jù)。而本研究還存在一定的局限性，未對elF5A2下調(diào)抑制自噬的具體機制進行分析，存在不足，后期將進一步研究。