慢性乙型肝炎患者病毒載量、PD-L1與肝纖維化及肝組織炎癥活動度的相關(guān)性分析

劉 甜，張 偉，梁俊榮， 徐 娜，張 婧，魏娟寧

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)是患者感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)后發(fā)生的持續(xù)感染，所導(dǎo)致的乙型肝炎慢性化的消化系統(tǒng)傳染性疾病[1-2]。乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(hepatitis B virus Deoxyribonucleic acid, HBV DNA)病毒載量是病毒復(fù)制、活動的標(biāo)志，該病病情的進(jìn)展、預(yù)后與HBV DNA之間有密切聯(lián)系[3-4]。相關(guān)研究指出，CHB患者的免疫功能異常，T淋巴細(xì)胞質(zhì)量及數(shù)量上有缺陷，機(jī)體無法通過自身細(xì)胞免疫功能清除HBV病毒[5]。程序性死亡因子配體1(programmed cell death ligand 1, PD-L1)可以誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，參與T細(xì)胞活化的過程并可發(fā)揮正性調(diào)控的作用，PD-L1的表達(dá)與CHB患者病情進(jìn)展有著顯著相關(guān)性[6]。為進(jìn)一步了解HBV DNA、PD-L1及肝纖維化對CHB患者肝組織炎癥活動度的影響，本研究選取了本院收治的102例CHB患者，分別探討了乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)表達(dá)陽性患者及HBeAg表達(dá)陰性患者的病理學(xué)指標(biāo)情況，為臨床治療CHB患者提供理論指導(dǎo)。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2018年4月—2019年4月本院收治的102例CHB患者的臨床資料。①納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；臨床資料完整；納入研究前未接受過抗病毒治療；年齡為21～78歲；對本研究知情并簽署同意書。②排除標(biāo)準(zhǔn)：合并甲型、丙型等其他類型的肝炎患者；長期嗜酒者；有長期特殊藥物服用史者；因精神障礙無法配合治療者。按照HBeAg表達(dá)不同分為HBeAg陽性組72例和HBeAg陰性組30例。HBeAg陽性組男39例，女33例；年齡21～75(43.85±3.54)歲。HBeAg陰性組男18例，女12例；年齡23～78(43.91±3.59)歲。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1HBV DNA測定：采用美國ABI公司提供的ABI 5700型熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀測定3組患者的HBV DNA，試劑盒由廣州達(dá)安基因股份有限公司提供。檢測過程應(yīng)嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.2生化指標(biāo)檢測：2組均于入院次日清晨空腹抽取靜脈血10 ml，去肝素鋰抗凝，采用密度梯度法分離單個細(xì)胞核，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)等量稀釋，加入10 ml淋巴細(xì)胞分層液中，離心后吸取單個核細(xì)胞層，PBS洗滌3次后重懸，在流式細(xì)胞儀上測定PD-L1水平。操作過程嚴(yán)格按照說明書流程完成。

1.2.3病理組織檢查：采用1 s快速穿刺肝組織活檢術(shù)采集肝臟組織，長度為1.5～2.0 cm。采集到的標(biāo)本使用4%甲醛溶液固定，經(jīng)常規(guī)石蠟切片、脫水后，使用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，光學(xué)顯微鏡觀察分析，并依據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[7]進(jìn)行病理分級。整個實驗操作過程嚴(yán)格按照說明進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1CHB患者肝組織病理活檢結(jié)果 102例CHB患者根據(jù)肝纖維化程度分級[8]分組：S1組21例，S2組52例，S3～S4組29例；根據(jù)炎癥活動度分組：G1組10例，G2組56例，G3～G4組36例。

2.2HBV DNA、PD-L1表達(dá)水平比較 HBeAg陽性組HBV DNA、PD-L1表達(dá)水平顯著高于HBeAg陰性組(P<0.01)。見表1。

表1 2組CHB患者HBV DNA、PD-L1表達(dá)水平比較

2.3HBeAg陰性組肝纖維化程度、炎癥活動度與HBV DNA及PD-L1表達(dá)比較 將HBeAg陰性組30例按照肝纖維化程度分為S1組6例，S2組15例，S3～S4組9例；3組間HBV DNA、PD-L1表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.030、0.001，P>0.05)。根據(jù)炎癥活動度將HBeAg陰性組分為G1組4例，G2組9例，G3～G4組17例。3組間HBV DNA、PD-L1表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.790、0.060，P>0.05)。見表2。

表2 HBeAg陰性的CHB患者肝纖維化程度、炎癥活動度與HBV DNA、PD-L1表達(dá)比較

2.4HBeAg陽性的CHB患者肝纖維化程度、炎癥活動度與HBV DNA、PD-L1表達(dá)比較 將HBeAg陽性組按照肝纖維化程度分為S1組15例，S2組37例，S3～S4組20例，3組HBV DNA、PD-L1表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.890、7.220，P<0.05)。根據(jù)炎癥活動度將HBeAg陽性組分為G1組6例，G2組47例，G3～G4組19例。3組HBV DNA、PD-L1表達(dá)水平比較有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.090、6.590，P<0.05)。見表3。

表3 HBeAg陽性CHB患者肝纖維化程度、炎癥活動度與HBV DNA、PD-L1表達(dá)比較

2.5不同HBeAg表達(dá)的CHB患者炎癥活動度分級、肝纖維化程度與HBV DNA、PD-L1相關(guān)性分析 HBeAg陽性CHB患者中，HBV DNA與炎癥活動度分級及肝纖維化程度均呈正相關(guān)(r=0.454、0.398，P<0.05)；PD-L1與炎癥活動度分級及肝纖維化程度也均呈正相關(guān)(r=0.428、0.356，P<0.05)。HBeAg陰性CHB患者HBV DNA、PD-L1與炎癥活動度分級、肝纖維化程度分級均無相關(guān)性(P>0.05)。見表4、表5。

表4 HBeAg表達(dá)陽性的CHB患者炎癥活動度分級、肝纖維化程度與HBV DNA、PD-L1相關(guān)性分析

表5 HBeAg表達(dá)陰性的CHB患者炎癥活動分級、肝纖維化程度與HBV DNA、PD-L1相關(guān)性

3 討論

既往研究認(rèn)為，CHB患者體內(nèi)細(xì)胞免疫功能低下，導(dǎo)致HBV在機(jī)體內(nèi)不斷復(fù)制，使肝細(xì)胞免疫病理損傷，引發(fā)持續(xù)感染導(dǎo)致患者病情加重。細(xì)胞免疫應(yīng)答過程中，輔助性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞均可影響細(xì)胞毒性T細(xì)胞，使其細(xì)胞數(shù)目及功能產(chǎn)生變化[9-10]。PD-L1屬于CD28/CT-LA-4家族，是一種共刺激分子。既往研究報道，PD-L1為調(diào)節(jié)抗HBV特異性T細(xì)胞免疫的關(guān)鍵分子，其提供的正向信號與慢性HBV感染關(guān)系極為密切[11]。文獻(xiàn)報道，HBV DNA升高可作為反映HBV復(fù)制最敏感的檢測指標(biāo)之一[12]。本研究結(jié)果顯示，HBeAg陽性組HBV DNA、PD-L1表達(dá)顯著高于HBeAg陰性組，進(jìn)一步證實了CHB患者HBeAg表達(dá)與HBV DNA、PD-L1之間存在密切聯(lián)系。有學(xué)者研究報道，HBeAg表達(dá)水平與血清病毒載量及PD-L1水平變化具有一致性[13]。分析其原因為HBeAg是一種可溶性蛋白，現(xiàn)臨床多依據(jù)HBeAg水平了解病毒復(fù)制、傳染及患者病情進(jìn)展情況，在部分CHB患者體內(nèi)核心區(qū)啟動子出現(xiàn)變異，導(dǎo)致HBeAg無法合成，所以會出現(xiàn)陰性表達(dá)，因此HBeAg陰性無法證明HBV復(fù)制水平降低或HBV已經(jīng)清除[14]。CHB是一種免疫介導(dǎo)性疾病，發(fā)病機(jī)制尚未明確，主要為肝細(xì)胞表面抗原與宿主的免疫應(yīng)答損害肝臟細(xì)胞[15]。HBeAg作為免疫耐受因子，HBeAg表達(dá)陽性可使CHB患者機(jī)體處于免疫耐受狀態(tài)，可見HBV DNA與肝臟損害程度之間無明顯聯(lián)系。HBeAg陰性的CHB患者HBV DNA不高，但患者機(jī)體內(nèi)水平未保持在平衡狀態(tài)，也會使病情發(fā)展，影響預(yù)后。趙明英和李春林[16]在相關(guān)研究中證實了這一觀點。

國內(nèi)外有較多學(xué)者報道，CHB患者與HBV DNA、PD-L1、肝纖維化及肝組織炎癥活動度之間的關(guān)系，但結(jié)果尚未達(dá)成一致[17-18]。本研究考慮到CHB患者體內(nèi)HBeAg表達(dá)水平存在差異，分別研究了HBeAg陽性及HBeAg陰性患者體內(nèi)HBV DNA、PD-L1表達(dá)情況及肝纖維化程度、肝組織炎癥活動度。結(jié)果顯示不同肝纖維化程度及炎癥活動度的HBeAg陰性組CHB患者HBV DNA、PD-L1水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；不同肝纖維化程度及炎癥活動度程度的HBeAg陽性組CHB患者HBV DNA、PD-L1水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與既往研究報道結(jié)果相似[19]。

本研究結(jié)果顯示，HBeAg陽性組CHB患者中，HBV DNA、PD-L1與炎癥活動度分級、肝纖維化程度呈正相關(guān)，可見HBV DNA及PD-L1水平越高，患者肝臟組織損傷程度越重；HBeAg陰性CHB患者中，HBV DNA、PD-L1與炎癥活動度分級、肝纖維化程度之間無顯著相關(guān)性，這一研究結(jié)果與Rao等[20]報道結(jié)果一致。考慮為HBeAg陽性的CHB患者乙型肝炎病毒的復(fù)制水平提高，會加速肝臟的損害程度，引發(fā)肝癌、肝硬化等惡性疾病的發(fā)生[21-22]。這提示臨床醫(yī)師對于HBeAg表達(dá)陽性CHB患者在治療時，可通過給予患者抗病毒治療阻礙肝臟病變的進(jìn)一步發(fā)展；同時可加強(qiáng)監(jiān)測CHB患者的HBV DNA、PD-L1，了解患者病情變化，制定有效的治療方案，減少肝臟癌變的概率，以保證患者生命健康，延長生存期[23]。

綜上所述，本研究初步探討了HBV DNA、PD-L1表達(dá)與其肝纖維化及肝組織炎癥活動度的相關(guān)性，結(jié)果顯示HBeAg陽性的CHB患者高HBV DNA、PD-L1表達(dá)會加重肝臟損害，而HBeAg陰性的CHB患者上述指標(biāo)之間無顯著相關(guān)性。但PD-L1在CHB患者中作用機(jī)制尚未明確，且本研究納入樣本量較少，CHB患者體內(nèi)HBeAg陰性表達(dá)及HBeAg陽性表達(dá)中HBV DNA、PD-L1水平與肝臟損害之間的相關(guān)性仍有待擴(kuò)大樣本量，延長研究時間進(jìn)一步探討。