生物發酵過程中在線液體分析的整體解決方案

文/ 蘭思杰

本文作者系Endress+Hauser分析產品專家。

發酵工藝的效率高度依賴于過程條件的準確性——只有在穩定受控的條件下，微生物的繁殖和收獲才能達到最佳。因而必須安裝一套成熟可靠的系統來采集生物反應器內的信息。

在生物發酵中，生物反應器的測量點繁雜，而且對衛生性和可追溯性有著極高的要求，如圖1所示。在這些信息當中，最重要的參數就是pH、溶解氧和細胞濃度，這些數據必須被精確地控制和記錄。

pH綜合表征了微生物代謝進程，是發酵過程中十分重要的控制參數。pH影響生物酶的活性和細胞膜的通透性，適當的pH會促進微生物的新陳代謝，反之則會抑制其活性，降低目標產物的得率，例如，胃蛋白酶的最適pH為1.5～2.2，胰蛋白酶的最適pH為8.0～9.0，唾液淀粉酶的最適pH為6.8。pH影響培養基成分的存在狀態和中間代謝物的解離，直接關系到生物反應方向和反應副產物。例如，黑曲霉在pH為2～3時發酵產生檸檬酸，在pH近中性時，則產生草酸。微生物發酵的不同階段有不同的pH值，因此精準的pH控制直接關系到生產效率，在發酵全周期中必須對pH實時監控。

圖1典型生物發酵中生物反應器的在線儀表測量點

發酵過程中的基質代謝、發酵產物的形成、菌體自溶都會引起介質的pH發生變化。在線pH測量不僅要求測量精準快速，同時要求傳感器及其對應的安裝支架完全滿足衛生要求，不引入雜菌和干擾微生物反應的物質，如單體丙烯酰胺和銀離子等。除此之外，也要求電極在耐受嚴苛的原位清洗（CIP）和原位消毒（SIP）后，依然能保持測量的穩定性，從而保障整個發酵周期中pH的可靠測量。

Memosens CPS171D：專為生命科學行業研發的pH電極

特制內加壓參比凝膠與離子捕捉阱

CPS171D采用特制的參比凝膠，不含單體丙烯酰胺和動物來源型成分，無細胞毒性，對生物活性沒有干擾，適用于微生物反應過程的監控。參比凝膠出廠前實現7 bar abs內加壓，以減緩介質成分浸入對參比系統的干擾。其內部具體結構如圖2所示。

參比凝膠不含銀離子，不會與培養基中的物質產生反應（例如，Tris與銀離子反應后，在電極內部形成黑色沉淀堵塞隔膜）。取而代之的是離子捕捉阱，與傳統電極內部直接投加離子捕捉劑不同的是，CPS171D將離子捕捉劑以微管型式固定在Ag/AgCl引線的周圍，可以有效地吸附SIP過程中引線溶解的銀離子，同時與過程中的雜質離子反應，從而保護引線與測量電勢鏈的完整，其內部構造如圖3所示。

圖2 CPS171D的內部結構示意圖（1.Memosens 感應式接頭；2.FKM O型圈，帶止推環；3.固定部件；4.電極內加壓氣泡指示器；5.Ag/AgCl引線，帶離子捕捉阱；6.衛生型微孔陶瓷隔膜；7.NTC 30K溫度傳感；8.Ag/AgCl內部參比引線；9.N Type耐高溫型玻璃敏感膜。）

圖3 CPS171D內部離子捕捉阱的局部構造圖

耐受頻繁CIP/SIP的N Type耐高溫型玻璃敏感膜

CPS171D采用特制的N Type耐高溫型玻璃敏感膜，參比系統不易老化黃變和液化，在頻繁的CIP/SIP下擁有非常好的零點/斜率穩定性及使用壽命。從50次標準SIP后電極的零點和斜率變化中就能一 見端倪，如圖4所示，不難發現，隨著玻璃敏感膜和凝膠的強化，電極耐受SIP的次數顯著提升。

圖4 CPS171D與傳統衛生型玻璃pH電極在SIP后的魯棒性變化

溶解氧是好氧微生物生長及合成代謝產物所必需的，但這并不意味著溶解氧的濃度越高越好，溶解氧濃度過高有時反而會抑制目標產品的形成。研究發現，發酵需氧量主要與產物的合成途徑有關，例如，谷氨酸發酵過程中，如果溶解氧濃度不足，會抑制谷氨酸的積累，并在厭氧合成路徑下產生乳酸和琥鉑酸。但是，維生素B12的生產過程中卻需要采用前期厭氧和后期好氧的方法。因此，發酵過程溶中溶解氧的控制實質是，控制發酵的前、中、后段每一個時期的溶解氧都能滿足合成路徑中優勢菌種的氧氣需求，控制溶解氧在合適的時機補料、補糖，從而實現產物的轉變。

因此，在線溶解氧測量不但對傳感器的衛生型設計和測量原理提出要求，更為顯著的需求是傳感器在反應器中必須能夠快速響應，并且穩定地反應發酵液中的溶解氧濃度，盡可能不受充氣過程中氣泡和攪拌帶來的影響。

以典型的好氧發酵為例。發酵前期為微生物對數生長期，菌體大量繁殖，菌體濃度不斷上升，耗氧量不斷增加，溶解氧濃度明顯下降。在對數生長期后，菌體耗氧量有所減少，溶解氧濃度維持平穩或小幅上升后，開始形成產物。發酵中后期，菌體呼吸強度趨于平穩，如不補料、補糖或改變供氧量，溶解氧濃度幾乎沒有變化。如果此時補充碳源或者糖分，發酵液對溶解氧的消耗量會產生變化，應隨補料時的菌齡、補料的種類和補料量，對溶解氧的濃度和維持時間進行控制，以達到新的平衡，不然會抑制目標產物的生成。發酵后期，隨著菌體衰老呼吸強度減弱和菌體的自溶，溶解氧濃度逐漸小幅升高，直至發酵結束。這一發酵過程中溶解氧的變化曲線如圖5所示。

圖5典型好氧生物發酵過程中溶解氧的變化曲線

圖6熒光淬滅法溶解氧傳感器的測量原理

表1 不同類型熒光帽的表面特性

Memosens COS81D：專門為發酵過程研發的熒光法溶解氧傳感器

更快的響應速度（t90＜10 s、t98＜20 s）和更高的穩定性

熒光淬滅法（測量原理如圖6所示）相較傳統的電化學法，不需要長時間的極化，沒有需要頻繁維護更換的覆膜帽、陰極和電解液。傳感器浸入在介質中時，介質和熒光層之間能夠迅速建立氧分壓平衡。傳感器光學部件向熒光層發出橙色光脈沖信號，記號體激發深紅色熒光。響應信號的衰減時間和強度與氧濃度和氧分壓直接相關。內置參比LED光源，對測量LED光源老化進行補償，保證整個生產批次的測量值均可靠。

獨特的C-shape防氣泡聚集型熒光帽

COS81D的熒光帽包含熒光層、光學隔離層和保護層以及載板，氧敏感分子（記號體）集成在光學活性層（熒光層）中，針對不同的應用工況有兩種截然不同的種類，分別是防氣泡聚集的C-shape型熒光帽和防磨損的U-shape型熒光帽。如表1所示，C-shape熒光帽通過將熒光層均勻地涂布在預拉伸凸起的載板上，從而使氣泡在接觸膜片表面時順膜片邊緣光滑地脫離熒光帽，減少氣泡對測量值產生干擾與波動。U-shape熒光帽將熒光層保護在電極的金屬感體內部，防止快速的流體沖擊，尤其是研磨性介質對膜片的沖刷，從而延長電極壽命。

OUSBT66：細胞增長和生物質量傳感器

細胞生長情況的實時監控是生物發酵過程控制的核心參數之一，使用在線的光密度計替代采樣細胞計數器是大勢所趨。在發酵和結晶應用中的衛生型近紅外光譜（NIR）吸收傳感器OUSBT66監測細胞生長、生物質量、藻類系統和結晶過程，可以實時提供可靠、精準的測量值，優化監測過程和提高產品率。

OUSBT66的內部構造如7所示，其測量原理基于經典的朗博比爾定律，即吸光度和吸光物質濃度之間為線性關系。光源向介質方向發射光線，光線穿過介質，介質另一端的檢測器測量穿透介質的光線。光電二極管檢測光線強度，并將其轉換成光電流。隨后，變送器將光電流轉換成吸光度（AU）或者光密度（OD）。

圖7細胞增長和生物質量傳感器的測量原理及構造示意圖

圖8在線傳感器和實驗室光度計測量固氮螺旋菌和根瘤菌的光密度值

A = -log(T) = εc ·OPL

T = I/I0

式中：

A——吸光度；

T——傳輸率；

ε——消光系數；

c——濃度；

OPL——光程；

I——檢測器接收光強度；

I0——光源發射光強度。

在某個5000 L的通過發酵方式進行固氮的生物反應器中，同時使用了在線近紅外傳感器和實驗室可見光光度計測試了不同階段固氮螺旋菌和根瘤菌的光密度值，如圖8所示，實驗結果表明在線傳感器和實驗室光度計之間的測量值誤差非常微小。同時，在線傳感器可以實時不間斷地測量罐體部的介質光密度值，無需取樣，不會受到介質在采樣、傳遞和等待過程中的變質和污染的風險。

結語

Endress+Hauser可為業界提供完整的發酵過程在線測量整體解決方案，幫助簡化項目、減少后期維護成本和停機時間。以便在設計階段即推行早期標準化，降低資本性支出（CapEx）和運營成本（OpEx），提高生產效率和投資回報率（ROI）。作為生物技術領域可靠的合作伙伴，無論是中試生產還是自動化生產過程，Endress+Hauser都能為客戶減少風險并優化績效，穩步提升質量。