人肝癌細(xì)胞97H中YAP下調(diào)對(duì)TGF-β1 mRNA的影響

王 成，孔亞林，劉承利，蒲 猛，趙 剛，張洪義

Yes相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）是Hippo通路下游的一種轉(zhuǎn)錄激活子[1]，它所在的Hippo通路主要行使調(diào)控細(xì)胞增殖功能。YAP蛋白與人和小鼠的肝癌進(jìn)展密切相關(guān)[2-3]。YAP基因在其他實(shí)體癌中[4-6]也被視為一種癌基因。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是肝細(xì)胞增殖的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，在肝再生晚期表達(dá)增強(qiáng)[7]。肝癌患者外周血中TGF-β1 mRNA明顯升高[8]。TGF-β1可通過激活Hippo通路來抑制YAP功能，從而抑制肝癌細(xì)胞增殖[9]，2種因子在調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖方面關(guān)系密切。目前針對(duì)YAP的靶向抑制是控制肝癌增殖的熱點(diǎn)，但靶向治療是否會(huì)帶來相關(guān)因子的變化和新的問題需要更多的關(guān)注。本研究擬應(yīng)用RNA干擾技術(shù)下調(diào)MHCC97H細(xì)胞中YAP mRNA水平，測(cè)試干擾后該細(xì)胞中TGF-β1 mRNA的變化，將有利于針對(duì)YAP基因的靶向治療的研究。另外，前期研究發(fā)現(xiàn)，MHCC97H細(xì)胞的YAP mRNA高于與其同源的另一肝癌細(xì)胞MHCC97L[10]。本研究擬測(cè)試YAP mRNA水平較低的MHCC97L細(xì)胞中TGF-β1 mRNA水平，并與MHCC97H細(xì)胞內(nèi)TGF-β1 mRNA水平相比較，進(jìn)一步在自然存在的肝癌細(xì)胞中尋找二者相關(guān)性的有力證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞系 人肝癌細(xì)胞系MHCC97（包括97H和97L）購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)，是裸鼠人肝癌轉(zhuǎn)移模型在體外建立的（97H肺轉(zhuǎn)移率為100%，97L肺轉(zhuǎn)移率較低，為40%）。

1.1.2 RNA干擾序列 用于行YA P基因干擾的序列選自短發(fā)夾R N A克隆庫(kù)。有效抑制靶點(diǎn)序列：YAP1 NM_001130145 Human,5'-CATTGCTGCTGTTAATGTA-3'。

1.1.3 PCR引物 所有引物為人源，由上海生工公司設(shè)計(jì)合成，經(jīng)Primer BLAST（NCBI）驗(yàn)證特異性好。Y A P引物：正向鏈序列：5'-ACCCACAGCTCAGCATCTTCG-3'，反向鏈序列5'-TGGCTTGTTCCCATCCATCAG-3'，引物長(zhǎng)度257 b p；TGF-β1引物：正向鏈序列5'-TTCCTGGCGATACCTCAGCAACC-3'，反向鏈5'-CGCTAAGGCGAAAGCCCTCAAT-3'，引物長(zhǎng)度131 bp；內(nèi)參GAPDH引物：正向鏈序列5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，反向鏈序列5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'，引物長(zhǎng)258 bp。

1.1.4 主要試劑、儀器 培養(yǎng)液：高糖DMEM（Hyclone）＋10%胎牛血清（Gibco），培養(yǎng)液加青、鏈霉素各100單位/ml。細(xì)胞裂解試劑：Trizol?Reagent（大連寶生物科技有限公司，中國(guó)）。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：PrimeScript?RT reagent Kit Perfect Real-Time DRR03S（大連寶生物科技有限公司，中國(guó)）。熒光定量PCR試劑盒：SYBR PremixEx Taq（Perfect Real-Time）DRR041S（大連寶生物科技有限公司，中國(guó)）。實(shí)驗(yàn)儀器：實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（羅氏，瑞士）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RNA干擾及PCR實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 慢病毒載體構(gòu)建 慢病毒載體（pMagic 4.1）構(gòu)建依托上海賽博醫(yī)療生物科技有限公司完成，編號(hào)：SB1262-C。慢病毒的包裝、濃縮和滴度測(cè)定結(jié)果滿意。

1.2.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染細(xì)胞 復(fù)蘇凍存的97H細(xì)胞，懸浮于含10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)、傳代2次。將細(xì)胞分為干擾組和對(duì)照組，每組各3份細(xì)胞。轉(zhuǎn)染：慢病毒溶于含聚凝胺（8 mg/ml，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，中國(guó)）培養(yǎng)基中。干擾組將含質(zhì)粒的慢病毒轉(zhuǎn)染97H細(xì)胞；對(duì)照組加入空載體，轉(zhuǎn)染時(shí)間為72 h，之后同時(shí)提取總RNA。

1.2.1.3 RNA提取 取干擾組及對(duì)照組的97H細(xì)胞加入Trizol試劑裂解細(xì)胞，應(yīng)用氯仿、異丙醇、乙醇純化RNA。紫外吸收檢測(cè)RNA的濃度和純度。

1.2.1.4 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 反應(yīng)體系配置按試劑盒（PrimeScript? RT reagent Kit Perfect Real-Time：DRR03S）操作。條件：37 ℃ 15 min（反轉(zhuǎn)錄）→85 ℃5 s（失活）所得產(chǎn)物用于下一步PCR擴(kuò)增。

1.2.1.5 熒光定量PCR 反應(yīng)體系按試劑盒（SYBR Premix Ex Taq Perfect Real-Time：DRR041S）配置。條件：95 ℃ 10 s→95 ℃ 5 s→60 ℃ 20 s×35 Cycles。應(yīng)用LightCycler軟件分析得出各個(gè)樣品YAP mRNA、TGF-β1mRNA及內(nèi)參的Ct值結(jié)果，共得到6組數(shù)據(jù)。

1.2.2 97H細(xì)胞與97L細(xì)胞中2種因子的mRNA水平比較（PCR實(shí)驗(yàn)） 復(fù)蘇凍存的97H和97L細(xì)胞，每種細(xì)胞各3份，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后同時(shí)行RNA提取、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA、熒光定量PCR，方法、試劑、條件同前面實(shí)驗(yàn)，測(cè)試2種細(xì)胞中YAP mRNA、TGF-β1mRNA及內(nèi)參的量。應(yīng)用LightCycler軟件分析得出各個(gè)樣品Ct值結(jié)果，共得到6組數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用2--△△Ct法[11]，比較RNA干擾前后97H細(xì)胞中2種因子的mRNA量的變化。應(yīng)用直接比較Ct值的方法，比較2種細(xì)胞中2種因子的mRNA量的差別。干擾因素少按內(nèi)參GAPDH的Ct值行數(shù)據(jù)加權(quán)，應(yīng)用Excel 2003對(duì)PCR結(jié)果行配對(duì)比較，并制作圖表，Ct值越低，mRNA水平越高，1個(gè)Ct值約相當(dāng)于2倍核酸拷貝數(shù)之差。

2 結(jié)果

2.1 MHCC97H細(xì)胞YAP mRNA和TGF-β1 mRNA變化 對(duì)YAP基因行RNA干擾后97H細(xì)胞內(nèi)的YAP mRNA總量較對(duì)照組減少，伴隨TGF-β1 mRNA量升高。干擾組和對(duì)照組細(xì)胞分別受干擾試劑及對(duì)照試劑作用72 h后，細(xì)胞內(nèi)的YAP mRNA和TGF-β1 mRNA同時(shí)發(fā)生變化，干擾組YAP mRNA拷貝數(shù)降低到對(duì)照組的48.3%（表1），同時(shí)TGF-β1 mRNA拷貝數(shù)升高到對(duì)照組的1.2倍（表2），變化明顯。

表1 MHCC97H細(xì)胞干擾組和對(duì)照組的YAP mRNA變化

表2 MHCC97H細(xì)胞干擾組和對(duì)照組的TGF-β1 mRNA變化

2.2 97H與97L細(xì)胞中TGF-β1 mRNA和YAP mRNA水平 YAP mRNA水平較低的97L細(xì)胞中TGF-β1 mRNA水平較高。在內(nèi)參GAPDH 的Ct相等的情況下，在同一種細(xì)胞97H細(xì)胞中YAP mRNA水平高于TGF-β1 mRNA，二者相差0.39個(gè)Ct值。在同一種細(xì)胞97L中YAP mRNA水平低于TGF-β1 mRNA，二者相差0.52個(gè)Ct值（圖1）。按內(nèi)參GAPDH的Ct值行數(shù)據(jù)加權(quán)后，比較2種細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)：97L細(xì)胞的YAP mRNA水平低于97H。同時(shí)，97L細(xì)胞的TGF-β1mRNA水平高于97H（圖1）。可見，自然存在的人肝癌97系列細(xì)胞中如YAP mRNA水平較低的細(xì)胞TGF-β1 mRNA水平較高。

圖1 2種細(xì)胞（97H、97L）中的2種因子mRNA的PCR反應(yīng)結(jié)果

3 討論

肝細(xì)胞癌中的YAP蛋白被認(rèn)為是影響病人無瘤生存期和總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[12]。針對(duì)YAP基因的靶向治療可能成為肝癌治療的重要方法。在前期研究中發(fā)現(xiàn)在人肝癌細(xì)胞MHCC97H中針對(duì)YAP基因的RNA干擾作用能夠抑制YAP蛋白表達(dá)，并抑制癌細(xì)胞增殖[10]，本研究所用干擾序列及方法與前期研究[10]相同。針對(duì)某一種靶基因的治療是否會(huì)影響其他相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)是靶向治療需要特別關(guān)注的問題。作為主要功能為抑制肝細(xì)胞增殖并在肝癌組織中呈高表達(dá)的TGF-β1是針對(duì)YAP的靶向治療需首先關(guān)注的基因，它與YAP基因的關(guān)系及在靶向治療中的變化會(huì)影響靶向治療的效果。

在人的正常肝臟中TGF-β1 mRNA和蛋白一般無明顯表達(dá)[13]，只有在肝發(fā)生纖維化或硬化時(shí)，間質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)TGF-β1 mRNA。然而已有研究證明肝細(xì)胞癌的細(xì)胞內(nèi)有相對(duì)較高的TGF-β1表達(dá)[14]。

本研究中，當(dāng)人肝癌細(xì)胞MHCC97H的YAP mRNA受RNA干擾作用而下調(diào)后，TGF-β1 mRNA水平出現(xiàn)同步升高。當(dāng)干擾組YAP mRNA拷貝數(shù)降低到對(duì)照組的48.3%，TGF-β1 mRNA拷貝數(shù)升高到對(duì)照組的1.2倍。這提示YAP基因和或蛋白變化會(huì)影響內(nèi)源性TGF-β1 mRNA水平，目前尚不知這種變化是否有利于實(shí)現(xiàn)抑制肝癌細(xì)胞增殖的最初目的。

另外，前期研究[10]證明97L細(xì)胞的YAP mRNA水平低于97H，并且其增殖力也低于97H，這是一種天然的水平比較，測(cè)試該細(xì)胞的TGF-β1 mRNA的水平可以回答天然存在的YAP mRNA水平下降是否伴隨TGF-β1 mRNA升高。因97H和97L是人肝癌細(xì)胞MHCC97的2種不同亞型細(xì)胞，從共同的細(xì)胞起源分離而來，具有同源性，不易受外因影響，兩者的比較更加科學(xué)。并且在同一細(xì)胞中行2種核酸的相對(duì)定量比較可減少誤差，較為科學(xué)，結(jié)果可信度大。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，97L細(xì)胞中YAP mRNA水平低于97H，而97L的TGF-β1 mRNA的確高于97H。不僅如此，還發(fā)現(xiàn)YAP mRNA和TGF-β1 mRNA在2種細(xì)胞中出現(xiàn)“此消彼長(zhǎng)”的現(xiàn)象，即在97H細(xì)胞中YAP mRNA水平高于TGF-β1 mRNA；在97L細(xì)胞中YAP mRNA水平低于TGF-β1 mRNA。

假設(shè)從97H細(xì)胞到97L細(xì)胞存在一個(gè)細(xì)胞演變過程，此過程中YAP mRNA水平下降，同時(shí)伴隨TGF-β1 mRNA水平升高，這種態(tài)勢(shì)與前述的YAP mRNA受干擾后的二者的變化結(jié)果非常相似。綜合基因干擾實(shí)驗(yàn)及自然存在的2種亞型肝癌細(xì)胞的對(duì)比研究后，可以認(rèn)為：在肝癌細(xì)胞中YAP的下調(diào)對(duì)內(nèi)源性TGF-β1 mRNA有明顯的上調(diào)作用。雖然早先已有研究提示，YAP可抑制TGF-Smad通路功能[15]，但YAP對(duì)肝癌細(xì)胞內(nèi)源性TGF-β1 mRNA的影響尚未見報(bào)道，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)YAP做為核轉(zhuǎn)錄因子有可能參與調(diào)控肝癌細(xì)胞自身的TGF-β1 mRNA的量，并起到抑制作用，即高水平Y(jié)AP存在時(shí)TGF-β1 mRNA水平受抑制，當(dāng)YAP水平下降時(shí)，TGF-β1 mRNA水平升高。這一結(jié)果對(duì)針對(duì)YAP基因的靶向治療研究有重要意義。