黃芩水提取物對植物軟腐病菌的抑制作用研究

于紫垣 孫悅 李分 楊芬 張瀟潔

摘? ? 要：通過打孔法和倍比稀釋法研究黃芩水提取物對植物軟腐病菌的體外抑菌效果，利用分析檢測系統細胞主要內容物的滲漏問題來檢測采用黃芩水提取液對供試菌細胞膜和細胞壁的破壞能力。研究可知：黃芩水提取物能有效抑制植物軟腐病菌的活性，破壞植物軟腐病菌的細胞壁和細胞膜，為黃芩的臨床應用提供理論基礎。

關鍵詞：黃芩;提取物;植物軟腐病菌;抑制作用

文章編號： 1005-2690（2021）04-0009-02? ? ? ?中國圖書分類號： R284.1? ? ? ?文獻標志碼： B

中藥黃芩指多年草本植物黃芩的干燥根，屬唇形科。黃芩療效確切，具有清熱燥濕、瀉火解毒、安胎、止血等作用，為中醫常用藥物之一[1]。黃芩可分離出黃苷、黃芩素、漢黃芩素等黃酮類主要成分，烯丙醇、石竹烯等揮發油類物質成分，多糖類活性成分，此外還含有鐵、銅、鋅、錳等微量金屬元素。隨著研究深入，發現黃芩的成分可以在許多疾病中發揮治療作用，如抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、心血管保護、抗高血糖和預防并發癥等。

雖然使用抗生素可以有效控制并根治許多由細菌、真菌等引起的感染性疾病，但由于抗生素濫用，導致出現耐藥菌株種類數增長及細菌加速變異，降低了抗生素的功效，這已成為當前主要臨床藥物治療中最棘手的難題之一。

研究黃芩水提取物對植物軟腐真菌的體外抑菌作用[2]，為解決耐藥問題提供了理論依據，也為今后研究應用提供了參考。

1? ?材料

（1）菌株：植物軟腐病菌的菌種由西北民族大學中馬實驗室菌種儲藏室提供。

（2）藥物與試劑：黃芩購自甘肅省蘭州紫光藥業有限責任公司;麥氏比濁管（廣州成儀儀器有限公司）;實驗室內制備液體LB肉湯、LB瓊脂平板等。

（3）儀器：儀器名稱與購入廠家如表1所示。

2? ?試驗內容

2.1? ?黃芩水提取物的制備

取黃芩粗粉80 g，按料液比1∶10加入一些純凈水浸泡24 h，加熱回流提取3次，每次2 h過濾后取上清液抽濾回收，下層濾渣繼續加入適量的純凈水加熱回流，將3次所取得的濾液放入旋轉蒸發儀內濃縮，體積至黃芩粗粉的重量80 g，將藥液直接放入凍干機烘干得到干燥固體后待用，研碎為粉末，即取得凍干粉。

2.2? ?抑菌圈的測定

取凍干粉加入純凈水稀釋，將其配制成0.125 g/mL的藥液。用滅菌過的接菌環挑單菌落置液體LB中放入33 ℃、180 r/min搖床中搖12 h，將菌液在搖床中取出，取2 mL加入新的液體LB中，放入搖床搖2 h，將搖好的菌液離心，倒掉上清液，加入PBS緩沖溶液搖勻，重復離心兩次，將最終的菌液加入適量的PBS緩沖溶液直至與M=0.5麥氏比濁管比濁相當（測吸光度為0.1，PBS緩沖液為對照）。取100 μL菌液均勻的涂滿瓊脂平板，后采用打孔法打孔器打孔，將孔內物用殺菌過的針頭挑出，將80 μL的藥液加入孔中，置33 ℃恒溫恒濕培養箱中培養24 h，測量抑菌圈直徑[3]。2.3? ?最小抑菌濃度（MIC）的測定

測定方法為微量稀釋法[4-5]。取經高壓滅菌過的試管，將已配制好的藥液按照一定倍數進行稀釋，1～10號試管內藥物濃度依次為0.125 g/mL、0.062 5 g/mL、0.031 25 g/mL、0.016 g/mL、0.008 g/mL、0.004 g/mL、0.002 g/mL、0.001 g/mL、0.000 5 g/mL、0.000 25 g/mL、0.000 125 g/mL。將上步制備的菌液用PBS緩沖溶液稀釋100倍后，取2 mL菌液分別加入1～10號試管中，陰性對照為第11號試管（只加2.0 mL液體LB和藥液，不加菌液）;陽性對照為第12號試管（加入液體LB 2.0 mL、菌液2.0 mL）。后將1～12號試驗管和對照管置于33 ℃搖床中24 h后取出，觀察澄清度，無菌生長最小抑菌濃度（MIC），重復3組試驗。

2.4? ?最小殺菌濃度（MBC）的測定

分別取上述MIC測定中無菌生長的3支試管液體，在無菌環境下用高溫滅菌后冷卻的接種棒將試管中各液體均勻涂在固體培養基上，放入33 ℃培養箱中恒溫培養12 h，觀察結果，無菌生長即為MBC。

2.5? ?DPPH法測定抗氧化活性

采用DPPH法測定黃芩苷清除自由基能力，反應系統中的抗氧化劑可以和DPPH的單電子進行配對而使 517 nm檢測波長降低，因此，可根據517 nm的變化來檢測自由基的清除情況，從而評價供試藥液的抗氧化能力。黃芩水提取液（溶于DMSO中）設置8個濃度梯度，分別為10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L、400 μmol/L。首先將1 mL 100 mmol/L醋酸鈉緩沖液（pH值5.5）、 0.1 mL 3 mmol/L 的DPPH乙醇溶液和1.87 mL乙醇放入小型離心管中。再將0.03 mL不同濃度配制好的黃芩水提取液加入離心管中，輕晃搖勻，置25 ℃恒溫培養箱中反應20 min后，于517 nm處測量其吸光度，所得結果記為A1。空白組只加入0.03 mL DMSO，其吸光度記為A2。對照組加入0.03 mL DMSO和0.1 mL l3 mmol/L 的DPPH乙醇溶液，所得結果記為A3。自由基的清除率是用吸光度來表示，吸光度減少，代表DPPH分子減少。清除率的計算公式為：清除率（%）=1-（A1-A2）/A3×100%。

2.6? ?細胞內化學成分的變化

通過檢測細胞內容物的滲漏來檢測細胞內化學成分的變化，以檢測黃芩水提取物對被測細菌細胞膜和細胞壁的破壞能力。將適量藥液加入植物軟腐病菌菌懸液中，使其最終質量濃度為1 MIC，作為一個試驗數據處理組;等量不含藥液的菌懸液作為研究空白對照組。將以上液體培養基于33 ℃、180 r/min搖床中恒溫培養20 h后，各吸取2 mL 進行高速離心（5 000 r/min，10 min），棄去上清液收集菌體;菌體用無菌生理鹽水經離心洗滌兩次，在常溫干燥箱里烘干，4 ℃條件下保存備用。分別于16 h、24 h在260 nm處測定細胞內容物的釋放。

3? ?結果與討論

3.1? ?結果

（1）黃芩抑菌圈平均直徑為12 mm。植物軟腐病菌對黃岑水提取液具有中度敏感性，黃芩水提取物對植物軟腐病菌有一定的抑菌作用。

（2）最小抑菌濃度（MIC）的測定表明，黃芩水提取液對植物軟腐病菌最低抑菌濃度為 0.031 25 g/mL。

（3）最小殺菌濃度（MBC）的測定表明，黃芩水提取液對植物軟腐病菌最低殺菌濃度為0.062 5 g/mL。

（4）試驗結果顯示，光譜圖中菌體加入藥物前后的紅外吸收光譜非常相似，在藥物作用16 h和24 h后，1 400.35 cm-1處的峰值明顯降低，對應于脂質和蛋白質中甲基的不對稱伸縮振動及胞嘧啶C-鳥嘌呤A對的C-N振動。如果試驗變量均勻，通常降低的峰值高度（即強度）降低，其中，所述官能團部分變小。說明藥物作用后植物軟腐病菌的細胞膜及細胞壁大部分被完全破壞，導致這些細胞主要內容物質發生滲漏，表明黃芩水提取液對植物軟腐病菌的細胞膜和細胞壁均有嚴重影響。

（5）試驗結果表明，黃芩具有較強的DPPH清除能力，且其隨著藥液濃度的加大而增強。當濃度達到100 μmol/L時， 清除率接近50%;濃度為400 μmol/L時，其抑制率高達91%。

3.2? ?討論

黃芩作為我國常用中藥之一，藥理作用廣泛，具有顯著的抗菌抗氧化作用和重要的臨床應用價值，需求量大，所含化學組成成分和分析作用廣。從試驗中可以得出黃芩水提取物對植物軟腐病菌有明顯的抑菌作用。

與傳統抗生素相比，中藥具有多靶點、不易產生耐藥性等優勢。今后應在充分挖掘黃芩潛在藥理作用的同時，還要注重考慮黃芩及其有效組分藥理活性及具體作用機制，積極發現并利用一些尚未被發現的活性組分。

參考文獻：

[ 1 ] 劉雄，高建德.黃芩研究進展[J].甘肅中醫學院學報，2007（2）：46-51.

[ 2 ] 馬建鳳，劉華鋼，朱丹.中藥體外抑菌研究的方法學進展[J].藥物評價研究，2010，33（1）：42-45.

[ 3 ] 張咪，黃欣玥.黃芩提取物對耐藥性金黃色葡萄球菌的抑制作用研究[J].化學工程與裝備，2018（10）：32-33.

[ 4 ] 孫長貴，張麗君，曾賢銘，等.微量稀釋法測定抗真菌劑對酵母菌MIC的評價[J].臨床檢驗雜志，2000（6）： 331-332，335.

[ 5 ] 晉興，武愛榮，黃波，等.用紙片擴散法和微量稀釋法進行藥物敏感性測定的比較[J].國際檢驗醫學雜志，2014，35（3）：322-324.

（編輯：劉佳欣）