循環腫瘤細胞在膀胱癌診療中的應用價值

苗岳松，劉 杰，劉 昕，王志勇

（承德醫學院附屬醫院泌尿外科，河北 承德 067000）

膀胱癌（bladder cancer）在泌尿系統疾病中比較常見，是嚴重影響居民生命健康的惡性腫瘤，且膀胱癌的發病率位列全球惡性腫瘤的第9 位[1]，但在我國泌尿系統腫瘤中發病率和死亡率排第1 位[2]。近年來，由于膀胱癌診療的技術不斷發展，膀胱癌患者的預后生存時間比過去有顯著增加，但影響膀胱癌患者無進展生存期的重要因素仍然是腫瘤的復發和轉移。研究表明，原發灶腫瘤脫落的細胞能夠進入血液循環系統并發生遠處轉移，而循環系統中腫瘤細胞的細胞學和基因遺傳學特征與原發灶內腫瘤的一致[3-6]，原發灶內的腫瘤細胞進入外周血形成循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs），進而導致腫瘤的復發或轉移。有學者報道，影像學檢查顯示的變化較外周血中CTCs 含量的變化滯后，提示循環腫瘤細胞的存在對腫瘤早期發生微轉移具有非常重要的意義[7]。已有研究證實，外周血中CTCs 含量可有效預測結直腸癌的預后、進展和總生存率[8]。因此，檢測膀胱癌患者外周血中CTCs 含量可輔助診斷膀胱癌。基于此，本研究通過檢測膀胱癌患者外周血中CTCs 含量，探究CTCs 陽性率與膀胱癌患者臨床特征的相關性，以期發現CTCs 在膀胱癌診療中的作用，為臨床診治膀胱癌提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年10 月～2019 年6 月河北省承德醫學院附屬醫院泌尿外科研究所收治的92例膀胱腫瘤患者作為試驗組，其中男77 例，女22例，年齡38～87 歲，平均年齡（66.10±9.67）歲，中位年齡64 歲。依據術后病理結果，將試驗組分為低級別尿路上皮癌30 例，高級別尿路上皮癌62 例，T1+T2期40 例，T3+T4期52 例，非肌層浸潤性膀胱癌39例，肌層浸潤性膀胱癌53 例。對照組選自我院門診同期健康體檢者20 例，其中男12 例，女8 例，年齡38～82 歲，平均年齡（65.20±10.94）歲，中位年齡68歲。兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究已通過河北省承德醫學院附屬醫院倫理委員會審查。

1.2 納入和排除標準 納入標準：①未接受過放療、化療、免疫治療及靶向治療；②無其他部位惡性腫瘤；③膀胱腫瘤患者的組織標本均經過病理確診為膀胱癌；④試驗組均達到相同的手術標準。排除標準：①原發病灶非膀胱的腫瘤；②患有免疫系統疾病；③有結核病史；④隨訪治療期間放棄治療或轉院者。

1.3 方法

1.3.1 富集 CTCs 采用上海寶藤醫學檢驗中心開發的SE-iFISH 技術富集及液染。先采用陰性富集法和免疫熒光染色技術從外周血中粗略獲取CTCs，再通過非血源性細胞分離介質將外周血中的紅細胞和白細胞去除后洗滌，獲得CTCs。

1.3.2 液染 選用熒光原位雜交技術染色鑒定CTCs含量。

1.3.3 實驗步驟 ①外周血采集：使用8 號采血針和EDTA 抗凝采血管采集大于7.5 ml 的外周血，將樣本搖晃混勻。②富集和液染CTCs：取7.5 ml 外周血，離心后棄去上清液，將去上清后的剩余樣本倒入A管中；把其中的血細胞堆積到分離介質上；將洗滌A管的洗滌液沿壁倒進帶有分離液的B 管；離心后把上清和白膜層放入C 管；將磁珠放于加有清洗液平底離心管，混勻后放在磁力架上，靜置后棄上清，重懸至原體積；將清洗后的磁珠加入C 管后，把C 管放在搖床上，搖動；加分離液于D 管中，把C 管中的磁珠混懸液滴在分離介質上；離心后把上清液倒入E 管中，再向E 管中加入清洗液，離心后棄上清，加入清洗液，將液體加至平底離心管中；把平底離心管放在磁力架上后用移液槍將管內液體轉移至F 管中；向F 管中加入清洗液，離心后棄上清，混勻細胞加入離心管中，將洗滌F 管后的洗滌液也加入H 管中；加入清洗液離心后棄上清；向細胞液中加入抗原修復液，向H 管中加入配制好的血細胞分析用染色液混合液，室溫避光孵育；洗滌液染后的細胞。加入組織固定液，涂片，室溫過夜晾干玻片。

1.4 熒光顯微鏡結果判讀 對已進行原位雜交免疫熒光染色后的iFISH CTCs 玻片使用熒光顯微鏡進行結果判讀。熒光信號釋義：紅色：抗人白細胞單克隆抗體群CD45；橙色：8 號染色體探針CEP-8 探針；綠色：CD31；藍色：細胞核定位染色劑DAPI。

1.5 結果分析 橙色熒光點為染色體著絲粒探針i－FISH 檢測結果。正常非腫瘤細胞為二倍體細胞，胞內兩個熒光點；腫瘤細胞為多倍體細胞，胞內大于兩個熒光點。藍色為DAPI 細胞核染色，所有有核細胞均為陽性。細胞無綠色信號，有橙色亮點，符合DAPI+/CD45-/CD31-/CEP8+（多倍體）CTCs 判定標準，見圖1。

圖1 SE-iFISH 對患者CTCs 的鑒定

1.6 觀察指標 所有患者每月電話隨訪1 次，每隔3個月門診隨訪1 次，每隔6 個月復查1 次腹部和盆腔CT。對患者性別、年齡、浸潤程度、病理分級、腫瘤分期、多樣性進行分析。

1.7 統計學方法 用SPSS 25.0 軟件進行統計分析，用Graph Pad Prism 8.0 軟件繪制統計圖。計數資料以（n，%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料采用[M（P25，P75）]表示，行非參數檢驗；ROC 曲線分析CTCs 診斷膀胱癌的臨界值，并計算其靈敏度、特異度、約登指數。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 術前CTCs 在膀胱癌診斷中的作用 使用ROC曲線判定區分膀胱癌組與對照組的臨界值，臨界值為1 個CTCs 時，AUC 面積和約登指數最大（AUC=0.951；Youden index=0.868），相應的靈敏度為91.30%，特異度為95.50%，假陽性率為4.50%，假陰性率為8.70%，準確性91.30%。因此，確立CTCs=1個/7.5 ml 為診斷膀胱癌的臨界值，術前膀胱癌患者外周血中CTC 的陽性率（CTC ≥1 個/7.5ml）為91.30%，對照組外周血中CTC 的陽性率4.50%，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 CTCs 對膀胱癌診斷的敏感性

2.2 CTCs 與膀胱癌患者臨床特征的關系 92 例膀胱癌患者檢測出CTCs 共計515 個，CTCs 范圍0～20個/7.5ml，中位數為4 個/7.5ml。不同浸潤程度、病理分級的膀胱癌患者CTCs 陽性率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；不同年齡、性別、腫瘤分期、多樣性的膀胱癌患者CTCs 陽性率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 CTCs 與膀胱癌患者臨床特征的關系（n）

3 討論

CTCs 主要由原發灶或轉移灶自發脫落或因手術操作釋放進入外周血中[9]，在腫瘤細胞改變細胞外基質成分的情況下，促使腫瘤細胞進入血管內[10]，形成能提高腫瘤細胞轉移能力的CTCs 簇，使少量腫瘤細胞逃避掉失巢凋亡機制存活的腫瘤細胞[11]，從而導致腫瘤的復發及轉移。CTCs 在健康人中很少檢測到，不過卻可以在大多數實體腫瘤患者的外周血液中檢測到CTCs[12]。因此，針對血液微轉移以及膀胱癌轉移的患者，可從循環系統中檢測CTCs 直接證明患者存在血液微轉移和腫瘤膀胱外轉移，進而輔助臨床的診斷和治療[13,14]。目前已有多位學者證實CTCs 可以用于結直腸癌、前列腺癌的療效監測和預后評價[15]，且采用SE-iFISH 技術檢測膀胱癌CTCs 的研究較少。因此，本研究利用SE-iFISH 技術檢測檢測膀胱癌患者外周血中的含量，探究CTCs陽性率與膀胱癌患者臨床特征的相關性，分析其在診療方面的應用價值。

本研究顯示，試驗組CTCs 陽性率為91.30%，高于CellSearch 系統CTCs 的4.90%～47.50%[16，17]，與其他同樣采用SE-iFISH 系統檢測CTCs 陽性率的研究結果基本一致[18，19]，進一步證實了SE-iFISH 檢測系統優于CellSearch 檢測系統。本研究結果顯示，CTCs的陽性率與浸潤程度和病理分級有相關性，與患者的性別、年齡、腫瘤分期、多樣性、淋巴結轉移均無關，原因可能有以下兩點：①臨床醫師對腫瘤的分期和分級具有一定程度的主觀性；②本研究采用的檢測技術和腫瘤分組不同有關，有研究采用的流式細胞術是利用熒光標記相應抗體檢測CTCs，該法敏感度較低[20]，只能間接反映腫瘤患者外周血液CTCs 的含量，而本研究采用的SE-iFISH 檢測系統是將免疫熒光染色法與原位熒光雜交法結合，可直接檢測腫瘤患者外周血的CTCs 含量。

本研究還存在一定的局限性：樣本量較少，隨訪時間較短，未能對膀胱癌患者進行生存分析。后期計劃進一步加大樣本量，動態監測，延長隨訪時間，探究CTCs 與膀胱癌患者預后的關系。

綜上所述，CTCs 檢測相較于傳統的組織學檢測具有相對無創，且重復性好以及節省時間和成本的優點，有利于對患者的診療及預后情況觀察。CTCs有望成為膀胱癌患者治療效果的觀察指標，檢測CTCs 能夠對膀胱癌的治療效果起到較為準確的預測作用。