辣木葉黃酮對緩解小鼠運動性疲勞的影響

（天津師范大學體育科學學院，天津 300387）

辣木（Moringa oleifera）是辣木科辣木屬熱帶落葉喬木，起源自印度西北部，目前在我國云南、廣西、廣東等地區均有種植[1]。辣木中含有豐富的碳水化合物、脂肪、蛋白質、維生素和礦物質等營養物質[2]。有研究發現，辣木葉中含有類胡蘿卜素、抗壞血酸、黃酮類、多酚類、多糖類和生物堿等多種生物活性物質，其中主要活性物質黃酮對機體具有調節代謝、抗氧化、殺菌抗炎、改善免疫力等作用[3]。

運動員由于長期高強度訓練和比賽，容易出現運動性疲勞的癥狀[4]。運動性疲勞是訓練和比賽負荷超過了機體承受的能力，而產生的暫時的生理機能減退現象，是訓練的生理反應，也是人體的自我保護機制[5]。但如果人體長期處于疲勞狀態，前一次運動產生的疲勞還未及時消除，新的疲勞又產生，疲勞就會積累，久之產生過度疲勞，導致機體尿素氮、睪酮、皮質酮、乳酸、乳酸脫氫酶、肌酸激酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、丙二醛等生化指標異常，引起暫時性的生理機能減退，影響運動成績，嚴重的運動性疲勞可導致運動員運動能力急劇下降，危及運動員的身體健康[6]。因此，及時消除運動性疲勞，提高機體的運動能力，對于運動員至關重要[7]。辣木葉營養豐富，具有抗氧化、抗疲勞、抗菌等功效[8]。2012年我國衛生部批準辣木為新資源食品，可用于功能食品研發[9]。鑒于辣木葉黃酮類物質具有極強的抗氧化能力，本研究采用小鼠過度訓練模型，研究辣木葉黃酮對過度訓練小鼠緩解運動性疲勞的功效。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級健康雄性BALB/c小鼠：50只，4周齡，體重18 g～20 g，許可證號 SCXK（京）2019-0003，北京維通利華實驗動物技術有限公司；辣木葉：云南天佑科技開發有限公司；紅景天西洋參膠囊：廣州賽健生物科技有限公司；血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、睪酮（testosterone，TTS）、皮質酮（corticosterone，CTC）、血乳酸（blood lactic acid，BLA）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、蒽酮等試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

ZH-PT型動物跑臺：淮北正華生物儀器設備有限公司；TGL-20B高速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；AL204電子天平：上海梅特勒托利多儀器有限公司；FSH-2型勻漿機：江蘇省金壇市環宇科學儀器廠；ALPHA 1-2 LD plus真空冷凍干燥機：德國Christ公司；TU-1901紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；iMagic-M7全自動生化分析儀：深圳市庫貝爾生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 辣木葉黃酮的制備

1）辣木葉去脂：將40 g辣木葉粉碎成粉末置于索氏提取器萃取管中，在燒瓶中加入400 mL石油醚設置溫度恒定70℃，經8 h冷凝回流后，30℃干燥30 min，即為去脂辣木葉粉末[10]。

2）提取辣木葉黃酮：將去脂辣木葉粉末按照料液比 1∶50（g/mL）加入 70%乙醇溶液中，超聲（200 W）輔助提取30 min，60℃下浸提90 min，然后8 000 r/min離心10 min，抽濾得到辣木葉黃酮上清液[10]。

3）分離純化辣木葉黃酮：取辣木葉黃酮上清液10 mL用HPD-750樹脂吸附2h，然后用20mL蒸餾水和30mL 70%乙醇依次洗脫樹脂表面黃酮，再用乙酸乙酯萃取純化，經測定黃酮含量為71.6%，通過反相高效液相色譜法測定其成分，異槲皮苷41.27%，槲皮素21.76%[10]。

將制備樣品與蒸餾水按照一定比例混合，得到質量濃度為10、20、40 mg/mL的灌胃液，備用。

1.3.2 動物分組、模型制備及運動訓練方案

試驗小鼠飼養條件：溫度20℃～22℃，相對濕度50%～55%，自然光照，自由飲水。小鼠普通飼料飼養一周，隨機分為5個試驗組，分別為模型組（MG組）、對照組（RG組）和辣木葉黃酮低（FMLL組）、中（FMLM組）、高劑量組（FMLH組），每組10只小鼠，共50只。

運動訓練方案：實驗小鼠先進行適應性跑臺訓練1周，跑臺坡度10°，跑速10 m/min，持續30 min。之后正式訓練8周，每周訓練6 d，休息1 d，跑臺坡度10°，跑速從10 m/min開始，每分鐘速率增加1 m/min，直至增加到40 m/min結束。訓練期間觀察并記錄實驗小鼠的一般表現（精神狀態、攝食量、睡眠、死亡率）及訓練狀況（動作協調性、跑步速度、是否疲勞、是否俯臥位、是否垂頭等）。

模型組（MG組）：每日定時灌胃1次蒸餾水100 mg/（kg·d），灌胃后1 h小鼠按照運動訓練方案進行訓練。

對照組（RG組）：將紅景天西洋參膠囊與蒸餾水配制成濃度為20 mg/mL的溶液，每日定時灌胃1次，灌胃劑量10 mL/（kg·d），折算劑量為200 mg/（kg·d），灌胃后1 h小鼠按照運動訓練方案進行訓練。

辣木葉黃酮低（FMLL組）、中（FMLM組）、高劑量組（FMLH組）：補充辣木葉黃酮溶液，濃度分別為10、20、40 mg/mL，每日定時灌胃 1 次，灌胃劑量10 mL/（kg·d），折算劑量為100、200、400 mg/（kg·d），灌胃后1 h小鼠按照運動訓練方案進行訓練。

1.3.3 小鼠體質量測定

試驗第1天和第56天定時（8：00）稱量小鼠體質量并記錄。

1.3.4 生化指標測定

小鼠末次運動后，眼球取血，血液樣品以3000r/min離心10 min，取上清液于-20℃保存；小鼠脫頸處死，取其肝臟和雙側后腿肌肉制備組織勻漿，分別剪取肝組織或肌組織放入燒杯中，用0.9%生理鹽水漂洗3遍，洗去血液，用濾紙擦干并稱取1 g，加入9 g生理鹽水，置于冷凍研磨機中粉碎勻漿，將制備的勻漿3 000 r/min離心10 min，取上清液于-20℃保存。血清、肝臟和肌肉組織嚴格按照試劑盒說明書檢測血清尿素氮（BUN）、睪酮（TTS）、皮質酮（CTC）、血乳酸（BLA）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、肌糖原、肝糖原等含量或活力指標。

1.4 統計分析

檢測數據表示為平均值±標準差，通過SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，以單因素方差分析進行顯著性差異檢驗，P＜0.05具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 實驗期間小鼠的一般表現

在整個實驗過程中，辣木葉黃酮高劑量組和對照組小鼠精神狀態、睡眠、食欲均良好。模型組小鼠及辣木葉黃酮低、中劑量組小鼠在第2周以后出現精神萎靡、食欲不振、嗜睡現象。第4周時，辣木葉黃酮低、中劑量組小鼠精神狀態恢復，睡眠良好，較為活潑。

2.2 辣木葉黃酮對小鼠體質量的影響

實驗期間辣木葉黃酮對小鼠體質量的影響如圖1所示。

圖1 辣木葉黃酮對小鼠體質量的影響（n=10）Fig.1 Effects of flavonoids from Moringa oleifera leaves on body weight of mice（n=10）

由圖1可知，實驗初期各組小鼠體質量無顯著差異，8周運動訓練后，各組小鼠體質量均增加，與模型組比較，辣木葉黃酮低、中、高劑量組、對照組小鼠體質量均顯著升高（P＜0.05）。模型組小鼠由于未使用任何營養補充劑，疲勞程度較重，食欲不振，體質量也低于辣木葉各劑量組。

2.3 辣木葉黃酮對小鼠血清抗疲勞指標的影響

實驗期間辣木葉黃酮對小鼠血清抗疲勞指標的影響如圖2所示。

圖2 辣木葉黃酮對小鼠血清抗疲勞指標的影響（n=10）Fig.2 Effects of flavonoids from Moringa oleifera leaves on the anti-fatigue levels of serum in mice（n=10）

由圖2可知，模型組小鼠血清睪酮含量顯著低于其它各組、皮質酮含量顯著高于其它各組，表明該組疲勞程度較重。與模型組比較，辣木葉黃酮低、中、高劑量組、對照組小鼠血清中睪酮含量分別升高11.0%、21.7%、26.6%、23.3%（P＜0.05），皮質酮含量各組分別降低 9.1%、15.8%、20.6%、18.3%（P＜0.05）。與模型組比較，辣木葉黃酮低、中、高劑量組、對照組小鼠血清尿素氮含量各組分別降低12.7%、21.1%、25.6%、21.8%（P＜0.05），當長時間高強度運動時，糖和脂肪供能不能滿足機體需求，蛋白質分解代謝水平加快，尿素氮是人體蛋白質代謝主要終產物，在肝臟中合成，血清中的尿素氮濃度隨運動負荷增加而增加[11]。本研究發現，辣木葉黃酮低、中、高劑量組小鼠的血清尿素氮濃度顯著低于模型組，表明辣木葉黃酮能有效減少運動中蛋白質的分解，延緩尿素氮的合成，提高機體對高強度運動負荷的適應能力[12]。與模型組比較，辣木葉黃酮低、中、高劑量組、對照組小鼠血乳酸含量分別降低12.5%、20.1%、22.2%、20.4%（P＜0.05），乳酸脫氫酶活力各組分別降低 12.6%、17.8%、20.5%、19.7%（P＜0.05），肌酸激酶活力各組分別降低18.7%、30.3%、38.1%、34.2%（P＜0.05）。在高強度運動中，機體以無氧酵解為主要供能方式，葡萄糖經過無氧酵解代謝后生成乳酸，隨運動強度的增加，血液及肌細胞中乳酸也隨之增加，乳酸脫氫酶可催化丙酸與L-乳酸之間的反應，其活力反映機體對運動負荷的適應能力，肌酸激酶在肌細胞中參與細胞內能量轉運、三磷酸腺苷合成、肌肉收縮，運動后可導致其活性明顯升高[13]。本研究發現，辣木葉黃酮低、中、高劑量組小鼠的血清中乳酸含量、肌酸激酶和乳酸脫氫酶活力顯著低于模型組，表明辣木葉黃酮可以有效清除高強度運動中機體無氧代謝產生的乳酸，降低肌酸激酶和乳酸脫氫酶活性，避免代謝產物堆積對機體產生的傷害，提高機體對高強度運動負荷的適應能力及抗疲勞能力[14]。與對照組比較，辣木葉黃酮中、高劑量組血清中睪酮含量、皮質酮含量、乳酸含量、尿素氮含量、乳酸脫氫酶活力和肌酸激酶活力沒有顯著差異，表明辣木葉黃酮改善運動性疲勞的效果與功效明確的抗疲勞物質功效類似[15]。

2.4 辣木葉黃酮對小鼠肝糖原和肌糖原儲備量的影響

實驗期間辣木葉黃酮對小鼠肝糖原和肌糖原儲備量的影響如圖3所示。

圖3 辣木葉黃酮對小鼠肝糖原和肌糖原儲備量的影響（n=10）Fig.3 Effects of flavonoids from Moringa oleifera leaves on the reserve of hepatic glycogen and muscle glycogen in mice（n=10）

由圖3可知，與模型組比較，辣木葉黃酮低、中、高劑量組、對照組小鼠運動后體內肝糖原儲備量和肌糖原儲備量均有顯著升高（P＜0.05）；與對照組比較，辣木葉黃酮低劑量組肝糖原和肌糖原儲備量分別降低34.5%和 24.4%（P＜0.05），辣木葉黃酮中、高劑量組沒有顯著差異。長期高強度運動，機體能源物質消耗、代謝物質積累，是運動性疲勞產生的重要原因[16]。在運動中葡萄糖為機體提供大量能量，供能的葡萄糖主要源自肝糖原和肌糖原分解。隨著運動耗能的持續，糖原儲備量也隨之減少，增加糖原的儲備量、節省糖原的利用，可以有效地提高機體的運動能力[17]。本研究發現，辣木葉黃酮低、中、高劑量組小鼠的肝糖原和肌糖原儲備量顯著高于模型組，表明辣木葉黃酮具有增加糖原儲備量、減少運動中能源消耗的作用，從而提高運動耐力，改善運動性疲勞的程度[18]。

2.5 辣木葉黃酮對運動疲勞小鼠血清和肝組織抗氧化效果的影響

實驗期間辣木葉黃酮對運動疲勞小鼠血清和肝組織抗氧化效果的影響如圖4所示。

圖4 辣木葉黃酮對運動疲勞小鼠抗氧化效果的影響（n=10）Fig.4 Effects of flavonoids from Moringa oleifera leaves on the antioxidation of serum and hepatic tissue in mice（n=10）

由圖4可知，與模型組比較，辣木葉黃酮低、中、高劑量組、對照組小鼠運動后血清中丙二醛含量分別降低 13.1%、20.1%、23.4%、23.0%（P＜0.05），肝組織中丙二醛含量分別降低18.1%、21.3%、29.2%、30.6%（P＜0.05），機體高強度運動時產生自由基，自由基催化生物膜中的多不飽和脂肪酸產生丙二醛等脂質過氧化物[19]。通過機體內丙二醛含量評價其脂質過氧化程度和細胞損傷程度，是反映機體氧化損傷的重要指標[20]。本研究發現，辣木葉黃酮低、中、高劑量組小鼠血清、肝臟中丙二醛含量顯著低于模型組，表明辣木葉黃酮可有效減弱過度訓練中細胞氧化應激反應，降低機體脂質過氧化損傷，減少丙二醛的生成，維持抗氧化系統的正常功能，緩解運動性疲勞的產生[21]。

與模型組比較，辣木葉黃酮低、中、高劑量組、對照組小鼠運動后血清和肝組織中過氧化氫酶活力、超氧化物歧化酶活力、谷胱甘肽過氧化物酶活力均顯著升高（P＜0.05），尤其是高劑量組，血清和肝組織中過氧化氫酶活力分別提高46.8%和20.4%，超氧化物歧化酶活力分別提高43.6%和19.2%，谷胱甘肽過氧化物酶活力分別提高31.2%和23.6%，隨著辣木葉黃酮攝入劑量的增加，抗氧化酶活力的提高也越明顯。與對照組比較，辣木葉黃酮中、高劑量組血清和肝組織中丙二醛含量、過氧化氫酶活力、超氧化物歧化酶活力和谷胱甘肽過氧化物酶活力沒有顯著差異。高強度長時間運動過程中，機體能量快速消耗，代謝產物大量積累，骨骼肌中氧自由基和其它活性氧/氮物質增加、抗氧化酶系不斷減少，高濃度活性氧可引起脂類、蛋白質、核酸以及細胞活性成分等發生功能性氧化損傷，促使細胞凋亡及抗氧化系統平衡作用失調，從而引發機體產生運動性疲勞[22]。為維持機體抗氧化系統平衡，提高抗氧化酶活力是關鍵[23]。本研究發現，辣木葉黃酮低、中、高劑量組小鼠血清、肝組織中過氧化氫酶活力、超氧化物歧化酶活力、谷胱甘肽過氧化物酶活力均顯著高于模型組，表明辣木葉黃酮可有效增強抗氧化酶的活力，提高抗氧化能力，加速清除自由基和活性氧，改善機體抗疲勞的能力[24]。

3 結論

綜上所述，辣木葉黃酮可以有效提高機體肝糖原和肌糖原的儲備量、增強過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶系的活力，加速血清尿素氮、丙二醛等代謝物質的清除，減少其在體內積累，降低氧化應激反應，保護細胞結構和功能的完整，抵抗和延緩運動性疲勞的產生[25]。本研究為辣木葉黃酮的開發利用提供參考。