氧化綠原酸改性鱈魚皮明膠功能特性的研究

陳力，安麗平

（1.石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與藥品工程系，河北 石家莊 050081；2.河北中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050200）

添加各類乳化劑是提高食品穩(wěn)定性的有效措施。蛋白質(zhì)作為一種天然乳化劑，在降低界面張力方面不如一些低分子量表面活性劑，如卵磷脂、單甘油脂和雙甘油脂等，但蛋白質(zhì)作為大分子的穩(wěn)定性卻要明顯優(yōu)于這些小分子量的乳化劑。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)除了可以降低界面張力外，還可以在油滴周圍形成一層連續(xù)的黏彈性界面膜，而低分子量表面活性劑卻不能形成這種黏彈性膜[1]。因此，蛋白質(zhì)作為食品乳化劑的一個主要潛在優(yōu)勢是能夠保護(hù)脂質(zhì)不受鐵離子催化氧化的影響。在pH值低于等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)在油滴周圍形成帶正電荷的界面膜，使靜電排斥水相中存在的任何Fe2+離子和Fe3+離子，從而防止油滴中多不飽和脂類的氧化[2]。

此外，蛋白質(zhì)中的氨基酸可以清除自由基、螯合氧化金屬。明膠是由動物的皮、骨骼以及肌腱中膠原蛋白變性或水解制成的，具有一定的表面活性，能夠在水包油乳狀液中起乳化劑的作用[3]。近年來，利用魚類的副產(chǎn)物提取明膠成為人們研究的熱點(diǎn)，然而，與哺乳動物明膠相比，魚類明膠的乳化性能較差。因此，提高魚類明膠的功能特性成為當(dāng)下研究的重點(diǎn)。

天然植物源酚類化合物是指具有羥基取代基的芳香環(huán)化合物，可作為金屬離子螯合劑、供氫劑、單線態(tài)氧猝滅劑或還原劑。這些酚類化合物容易被氧、臭氧或多酚氧化酶氧化成醌。醌可以在副反應(yīng)中形成二聚體，或通過共價或氫鍵與蛋白質(zhì)氨基側(cè)鏈反應(yīng)[4]。因此，氧化酚類化合物可以作為蛋白質(zhì)交聯(lián)劑，來改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。并且，酚類化合物可以修飾蛋白質(zhì)的抗氧化活性。氧化酚類化合物還可以與蛋白質(zhì)相互作用形成相當(dāng)穩(wěn)定的復(fù)合物，這些復(fù)合物能夠抵抗蛋白質(zhì)變性劑的破壞[5]。然而，關(guān)于酚類化合物對明膠的改性及其對乳狀液穩(wěn)定性和脂質(zhì)氧化影響的研究還很少。因此，本研究通過氧化綠原酸（oxidized chlorogenic acid，OCA）對鱈魚皮明膠進(jìn)行改性，探討改性后鱈魚皮明膠的乳化特性和抗氧化活性以及其對乳狀液脂質(zhì)氧化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱈魚皮：大連天寶綠色食品有限公司；綠原酸、十二烷基磺酸鈉、2，4，6-三硝基苯磺酸：美國Sigma公司；鹽酸、過氧化氫、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、亞硫酸鈉、三氯化鐵：上海化學(xué)試劑有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthacenesulfonis acid，ANS）：艾美捷科技有限公司；透析袋：索萊寶科技有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T18勻漿機(jī)、C-MAGHS10型磁力攪拌器、5500型冷漿離心機(jī)：日本KUBOTA以司；C-MAGHS10型磁力攪拌拌器：德國IKA公司；AH-basic型高壓均質(zhì)機(jī)：上海順儀實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FE20 pH計：梅特勒-托利儀器（上海）有限公司；ANS-熒光探針：美國Sigma公司；5500型冷凍離心機(jī)：日本KUBOTA公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鱈魚皮明膠的提取

將鱈魚皮沖洗后切成小塊（1 cm×1 cm），25℃下用0.05 moL/L NaOH攪拌鱈魚皮6 h，每隔1 h更換一次溶液，持續(xù)6 h。然后用蒸餾水清洗堿處理過的鱈魚皮，直到洗滌水的pH值為中性。用5% H2O2漂白48 h，然后用蒸餾水沖洗3次。用蒸餾水（60℃）從漂白過的鱈魚皮中提取明膠，提取時間為12 h，樣品與水比為1∶2（g/mL）。使用冷凍離心機(jī)在8 000 r/min下離心30 min，以去除不溶性物質(zhì)，收集上清液并冷凍干燥。

1.3.2 氧化綠原酸對鱈魚皮明膠的改性

將鱈魚皮明膠溶解于含0.02%疊氮化鈉的蒸餾水中，得到最終濃度為1.2%的蛋白質(zhì)。用1 moL/L NaOH將明膠溶液調(diào)節(jié)至pH 9.0。在蒸餾水中溶解濃度為2%的綠原酸溶液，然后用1 moL/L NaOH調(diào)節(jié)至pH 9.0。然后在40℃下用氧氣將溶液鼓泡1 h，將綠原酸轉(zhuǎn)化為氧化形式。向75mL明膠溶液中添加不同濃度（2.5%、5.0%、10.0%和20.0%）的氧化綠原酸溶液。使用蒸餾水（pH 9.0）將最終體積補(bǔ)至90 mL，使用磁力攪拌器在25℃下以200 r/min連續(xù)攪拌混合物12 h。此后，樣品透析24 h，以去除游離酚類化合物（未與蛋白質(zhì)結(jié)合）。

1.3.3 游離氨基含量的測定

根據(jù)BENJAKUL等[6]的方法測定樣品的游離氨基含量。向125 μL樣品中添加2.0 mL 0.2 moL/L磷酸鹽緩沖液（pH 8.0）和 1.0 mL 0.01%2，4，6-三硝基苯磺酸溶液充分混合，并置于50℃的水浴中進(jìn)行30 min暗反應(yīng)。添加2.0 mL 0.1 moL/L亞硫酸鈉終止反應(yīng)，并將混合物在25℃下冷卻15 min。在420 nm處測吸光度，并以L-亮氨酸表示游離氨基含量。

1.3.4 表面疏水性的測量

根據(jù)BENJAKUL等[6]的方法進(jìn)行測定，用1-苯胺基萘-8-磺酸作為探針，明膠溶液（4 mg/mL）在含有0.6 moL/L NaCl的10 mmoL/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）中稀釋，得到0.1%、0.2%、0.3%和0.5%的蛋白質(zhì)濃度。在0.1 moL/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中，將稀釋的蛋白質(zhì)溶液（2 mL）與20 μL 8 mmoL/L ANS混合。在374 nm的激發(fā)波長和485 nm的發(fā)射波長下，測定熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度作圖，斜率為表面疏水性。

1.3.5 濁度的測定

根據(jù)PEARCE等[7]的方法測定，稍作修改。大豆油（2 mL）和明膠溶液（1%蛋白質(zhì)，6 mL）用均質(zhì)機(jī)以20 000 r/min的速度均質(zhì)1 min。在放置0和10 min時取乳狀液用0.1%十二烷基硫酸鈉稀釋100倍后振蕩10 s，測得的吸光值A(chǔ)500為濁度。

1.3.6 抗氧化活性的測定

1）DPPH自由基清除活性：根據(jù)BINSAN等[8]的方法，稍加修改。將1 mL樣品和4 mL 0.10 mmol/L的1，1-二苯基-2-苦味酸（DPPH）溶液混合，25℃下黑暗放置30 min后在517 nm波長處進(jìn)行比色。

式中：A為加入樣品后溶液的吸光度；B為樣品的吸光度；C為未加樣品溶液的吸光度。

2）Fe2+的螯合活性：根據(jù) NOOSHKAM 等[9]方法測定。將4.7 mL樣品與0.1 mL 2 mmol/L氯化亞鐵和0.2 mL 5 mmol/L三氯化鐵混合，在25℃下靜置20 min，然后在562 nm處讀取吸光度。

式中：A為樣品的吸光度；B為空白的吸光度。

1.3.7 硫代巴比妥酸值（thiobarbituric acid reactant，TBARS）的測定

根據(jù)BUEGE等[10]的方法，并稍作修改。將大豆油和氧化綠原酸改性后的明膠溶液（1∶9，體積比）在10 000 r/min下均質(zhì)2 min，然后在40 MPa的壓力下高壓均質(zhì)2次，加入0.02%的NaN3作為抗菌劑。將2 mL乳狀液樣品分散于10 mL硫代巴比妥酸溶液（0.375%硫代巴比妥酸、15%三氯乙酸和0.25 moL/L鹽酸）。混合物在沸水中加熱10 min后冷卻。混合物在3 600 g下離心20 min，在532 nm處測定上清液的吸光度。以1，1，3，3-四乙氧基丙烷做標(biāo)準(zhǔn)曲線確定硫代巴比妥酸值。

1.4 統(tǒng)計分析

每一個試驗(yàn)重復(fù)操作3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Statistix 8.1中Linear Models程序進(jìn)行，差異顯著性（P＜0.05）分析使用Tukey HSD程序。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化綠原酸對鱈魚皮明膠游離氨基含量的影響

不同濃度氧化綠原酸改性鱈魚皮明膠的游離氨基含量見圖1。

圖1 不同濃度氧化綠原酸對鱈魚皮明膠游離氨基含量的影響Fig.1 Effect of different concentrations of oxidized chlorogenic acid on free amino content of cod skin gelatin

由圖1可知，氧化綠原酸改性明膠的游離氨基含量均低于對照明膠（不含OCA），這表明親核氨基可能與酚類化合物的氧化形式親電醌相互作用，導(dǎo)致游離氨基含量降低。隨著OCA濃度的增加，游離氨基的損失增加（P＜0.05）。經(jīng) 2.5%、5.0%、10.0%和 20.0%的OCA修飾后，鱈魚皮明膠的游離氨基含量分別下降到8.24、8.01、7.83、7.30 mmol/L。這是因?yàn)檠趸蟮姆宇惢衔锟膳c蛋白質(zhì)分子的色氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、組氨酸、酪氨酸和脯氨酸等親核基團(tuán)反應(yīng)[11]。并且，氧化后的酚類化合物轉(zhuǎn)變成醌類化合物，其中包含了大量的反應(yīng)性親電分子，這些分子很容易與蛋白質(zhì)或氨基酸的官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)游離氨基含量降低[12]。

2.2 氧化綠原酸對鱈魚皮明膠表面疏水性的影響

氧化綠原酸對鱈魚皮明膠表面疏水性的影響見圖2。

圖2 不同濃度氧化綠原酸對鱈魚皮明膠表面疏水性的影響Fig.2 Effect of different concentrations of oxidized chlorogenic acid on the surface hydrophobicity of cod skin gelatin

1-苯胺基萘-8-磺酸是一種熒光探針，可與苯丙氨酸、色氨酸等含芳環(huán)的疏水性氨基酸結(jié)合，可用來指示蛋白質(zhì)的表面疏水性。由圖2所示，與對照明膠相比，OCA修飾的鱈魚皮明膠表面疏水性顯著降低（P＜0.05）。所有OCA改性的明膠表面疏水性隨OCA濃度的增加而降低（P＜0.05）。明膠表面疏水性的降低表明，氧化酚類化合物可以幫助明膠分子形成親水性更強(qiáng)的構(gòu)象。氧化酚類化合物改性的明膠表面疏水性的降低可能是由于酚類化合物的羥基和羧基附著在明膠上所致。酚類化合物的共價結(jié)合復(fù)合物對蛋白質(zhì)的親水性造成阻礙，如氨基和硫醇基[13]。另一方面，引入的非極性基團(tuán)（苯環(huán)）和極性基團(tuán)（如酚酸中的羥基和羧基）的數(shù)量也在增加[3]。

2.3 氧化綠原酸對鱈魚皮明膠濁度的影響

氧化綠原酸對鱈魚皮明膠濁度的影響見圖3。

圖3 不同濃度氧化綠原酸對鱈魚皮明膠濁度的影響Fig.3 Effect of different concentrations of oxidized chlorogenic acid on turbidity of cod skin gelatin

濁度的大小能夠反映出蛋白質(zhì)的乳化活性，可用來研究蛋白質(zhì)與酚類化合物之間通過共價或非共價相互作用的復(fù)雜行為[14]。圖3顯示了不同濃度下氧化綠原酸改性鱈魚皮明膠的濁度。與對照組相比隨著OCA濃度（2.5%～10.0%）的增加，濁度顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。這可以解釋為氧化酚類化合物與明膠的相互作用可能導(dǎo)致明膠分子的聚集[15]。WANG等[16]研究表明，玉米醇溶蛋白水解物和單寧酸之間形成的微聚集可顯著提高溶液的乳化活性。由于明膠與氧化酚類化合物的相互作用，通過共價C-S鍵或C-N鍵與巰基或氨基側(cè)鏈形成二聚體或共價共軛物，從而導(dǎo)致微聚集。蛋白質(zhì)的表面疏水性通常與其表面活性有關(guān)，通過降低界面張力，改善乳化活性。然而，當(dāng)OCA的濃度超過5%時，濁度有所下降，并且隨著氧化酚類化合物濃度的增加，這種下降更為明顯。這可能是氧化酚類化合物降低了明膠在油水界面的定位能力，明膠可能無法在油水界面展開，無法有效地在油滴周圍形成薄膜[17]。因此，氧化酚類化合物在明膠中較高的添加量對改性明膠的乳化性能有不利影響。

2.4 氧化綠原酸對鱈魚皮明膠抗氧化性的影響

氧化綠原酸對鱈魚皮明膠抗氧化性的影響見表1。

表1 氧化綠原酸對鱈魚皮明膠抗氧化性的影響Table 1 Effect of oxidized chlorogenic acid on antioxidant activity of cod skin gelatin

如表1所示，與對照相比，當(dāng)明膠與2.5%、5%、10%、20%的OCA混合時，自由基清除活性分別提高到33.78%、38.94%、43.25%和50.06%。結(jié)果表明，在明膠中引入酚類化合物有助于提高明膠的抗氧化活性。氧化酚類化合物對明膠DPPH自由基的清除作用可能是由于它們的供氫能力。氧化酚類化合物的游離醌主要還原為羥基，這些羥基可以為DPPH自由基提供氫。此外，F(xiàn)e2+作為促氧化劑，可以催化生成羥基自由基，從而加速脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。明膠的金屬螯合活性隨著OCA濃度的增加而增加（P＜0.05）。可見，OCA改性的明膠能夠減少過渡金屬的可用性，限制自由基介導(dǎo)的氧化連鎖反應(yīng)，使氧化前的金屬被隔離，導(dǎo)致氧化程度降低[18]。

2.5 氧化綠原酸對鱈魚皮明膠TBARS值的影響

氧化綠原酸對鱈魚皮明膠TBARS值的影響見圖4。

圖4 不同濃度氧化綠原酸對鱈魚皮明膠TBARS值的影響Fig.4 Effect of different concentrations of oxidized chlorogenic acid on TBARS value of cod skin gelatin

如圖4所示，隨著OCA濃度的增加，明膠中的TBARS值顯著降低（P＜0.05）。在貯存的前3 d內(nèi)，明膠中的TBARS值較低。此后，明膠中的TBARS值顯著增加，尤其是對照組增加的尤為顯著。可能是較高濃度的OCA改性的明膠對脂質(zhì)氧化的預(yù)防作用，可能與油滴周圍較厚的薄膜有關(guān)，這可以更有效地防止氧氣滲入油滴，能夠有效地延緩脂質(zhì)氧化。因此，氧化綠原酸改性明膠具有延緩水包油乳狀液TBARS生成的能力。INTARASIRISAWAT等[19]研究表明蛋白水解物穩(wěn)定乳狀液，通過加入不同量的氧化綠原酸，可以顯著抑制脂質(zhì)氧化。氧化綠原酸的附著可以誘導(dǎo)更多的羥基，從而提高明膠的供氫能力，從而保護(hù)乳狀液免受氧化。并且，氧化綠原酸改性的明膠在界面膜上提供了一個改進(jìn)的物理屏障，促進(jìn)了乳狀液在儲存期間的氧化穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

在本研究中不同濃度的氧化綠原酸對鱈魚皮明膠的抗氧化能力和乳化性能都具有一定的影響。氧化綠原酸可與明膠分子中的親核基團(tuán)反應(yīng)，并且氧化綠原酸的羥基和羧基能夠附著在明膠上，導(dǎo)致蛋白質(zhì)游離氨基含量和表面疏水性降低。氧化綠原酸和明膠之間形成的微聚集可顯著提高溶液的濁度，5.0%氧化綠原酸改性明膠的濁度最高，較高濃度的氧化綠原酸會影響明膠的乳化性能。氧化綠原酸能夠增加明膠的供氫能力，提高自由基清除能力。氧化綠原酸改性的明膠可作為螯合劑，減少過渡金屬的可用性，增加抗氧化活性。此外，利用氧化綠原酸改性的明膠在貯藏期內(nèi)比對照明膠能更有效地抑制脂質(zhì)氧化。