芥菜總黃酮超聲輔助提取工藝優化及其脂質抗氧化研究

陳建福，陳健旋，林媛，邱小明，莊遠紅

（1.漳州職業技術學院食品工程學院，福建 漳州 363000；2.福建農林大學金山學院飲食文化傳承研究中心，福建 福州 350002；3.閩南師范大學生物科學與技術學院，福建 漳州 363000）

芥菜[Brassica juncea（L.）Czern.et Coss.]是我國常見的一種特產蔬菜，十字花科，蕓苔屬一年生或二年生草本植物，分布于我國秦嶺淮河以南的大部分地區[1]。芥菜營養豐富，含有維生素、胡蘿卜素、膳食纖維、黃酮等多種天然營養與保健成分，具有利膈開胃、通肺、明耳目、抗癌、抑菌等多種生理功能[2-3]，其中黃酮是一類廣泛存在于植物體中，并具有抗病毒、抗菌、抗氧化、抗腫瘤等特殊功能的天然高分子化合物，已廣泛應用于食品、化妝品和醫藥等領域中[4-5]。

食用油脂在外界條件如酶、氧、熱、光、微生物等的作用下會發生氧化而酸敗變質，變質后的油脂會導致含油脂食品感官和營養品質的惡化[6-7]。為防止油脂的酸敗，提高油脂食品的食用安全，延長其貨架期，添加抗氧化劑是最有效的手段，而合成的抗氧化劑對人體存在一定的危害[8]，尋找高效、無毒的天然抗氧化劑來取代合成抗氧化劑具有極其重要的現實意義[9]。黃酮類化合物有延緩油脂脂質過氧化的作用，林國榮等[10]對柿葉黃酮進行提取與純化，研究了柿葉黃酮的脂質抗氧化能力，結果表明柿葉黃酮對大豆油和豬油均有一定的抗氧化作用，且抗氧化作用強于維生素C。超聲波輔助提取法是一項新型的天然產物輔助溶劑提取技術，能大大提高有效成分的提取率，同時具有耗時短、操作簡便、有效成分損失少等優點，具有良好的應用前景[11]。為提高芥菜總黃酮的開發利用率，本文以芥菜為原料，采用超聲波輔助提取法，對影響芥菜總黃酮提取率的工藝因素進行Box-Behnken設計與響應面優化，并評價了芥菜總黃酮的抗脂質氧化作用，為芥菜總黃酮的提取與應用于提高油脂產品的貨架期提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芥菜：市售；蘆丁（標準品＞98%）：上海金穗生物科技有限公司；乙醇（食品級）：河南鑫河陽酒精有限公司。

KQ-100TDE型高頻數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；UV-1100型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；DHG-9030A型鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；TP-114型電子天平：丹佛儀器（北京）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 芥菜總黃酮的提取工藝

芥菜—洗凈—烘干—粉碎—過篩—提取—過濾—濃縮—定容—芥菜總黃酮提取液

用蒸餾水將新鮮芥菜洗凈，濾水，后置于50℃鼓風干燥箱中干燥，后粉碎，過80目篩，備用。用電子天平準確稱取1.000 0 g備用的芥菜粉末于100 mL的圓底燒瓶中，加入一定體積和一定濃度的乙醇并裝上冷凝管，后置于一定溫度的超聲波清洗器上進行超聲回流提取一定的時間，結束后，將芥菜渣過濾，濾液進行濃縮，定容，計算芥菜總黃酮的提取率。

1.2.2 芥菜總黃酮的測定

1.2.2.1 標準曲線的測定

將蘆丁標準品用乙醇溶解，并配制成一定質量濃度的蘆丁母液，取蘆丁母液配制成一系列質量濃度梯度的蘆丁標準溶液，參照文獻[12]方法加入一系列試劑進行顯色，并在510 nm處測定吸光度，以蘆丁質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制曲線擬合得回歸方程 y=9.930 7x-0.005 5，R2=0.999 4。

1.2.2.2 芥菜總黃酮提取率的測定

用移液槍準確吸取一定量體積的芥菜提取液，并按照1.2.2.1方法進行吸光度測定，通過回歸方程計算得芥菜總黃酮的質量濃度，換算為芥菜總黃酮的提取率。

式中：b為總黃酮質量濃度，mg/L；V為提取液體積，L；m 為芥菜的質量，g。

1.2.3 單因素試驗

除變量外固定其他工藝條件 [超聲時間、液料比、乙醇濃度和超聲溫度為 25 min、30∶1（mL/g）、75%和70℃]不變的情況下，分別考察超聲時間（10、15、20、25、30、35 min）、液料比 [15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1（mL/g）]、乙醇濃度（60%、65%、70%、75%、80%和85%）、超聲溫度（55、60、65、70、75、80℃）對芥菜總黃酮提取率的影響。

1.2.4 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以芥菜總黃酮提取率為響應值，進一步對所考察的超聲時間（A）、液料比（B）、乙醇濃度（C）和超聲溫度（D）4個因素進行Box-Behnken試驗設計，分別以-1、0、1對各因素的3個水平進行編碼，見表1。

表1 響應面試驗設計Table 1 Experimental design of response surface

1.2.5 芥菜總黃酮的脂質抗氧化活性

1.2.5.1 芥菜總黃酮對大豆油的抗氧化活性

在6個小燒杯中分別加入50 g大豆油，依次加入0.00%、0.01%、0.02%、0.03%和 0.04%（以大豆油質量為基準）的芥菜總黃酮和0.02%的維生素C（使用時用75%乙醇將芥菜總黃酮和維生素C配制成50 g/L的溶液），置于（60±1）℃的恒溫烘箱中，每隔1 d取樣，并按GB 5009.227—2016《食品安全國家標準食品中過氧化值的測定》方法對油脂過氧化值（peroxide value，POV）進行測定。

1.2.5.2 芥菜總黃酮對豬油的抗氧化活性

在6個小燒杯中分別加入50 g豬油，依次加入0.00%、0.02%、0.04%、0.08%和0.1%（以豬油質量為基準）的芥菜總黃酮和0.04%的VC，置于（60±1）℃的恒溫烘箱中，在試驗第 0、2、4、7、10、15 天分別取樣，測定油脂的過氧化值。

1.3 數據處理

采用Excel 2007、Origin 7.50和Design-Expert8.05b進行數據統計、制圖、響應面設計及方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲時間對芥菜總黃酮提取率的影響

超聲時間對總黃酮提取率的影響見圖1。

圖1 超聲時間對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effects of ultrasound time on the extraction yield of total flavonoids

從圖1中可知，隨著超聲時間的延長，芥菜總黃酮提取率不斷增大，在超聲時間為25 min時達到最大，繼續延長超聲時間，總黃酮提取率反而下降，這是因為當超聲時間較短時，芥菜顆粒與溶劑接觸時間較短，部分黃酮類物質還沒來得及溶出，總黃酮提取率較低，但超聲時間過長時，部分穩定性較差的黃酮類分子在長時間的空化與熱作用下會發生降解[13]，使得總黃酮的提取率反而降低。因此最佳超聲時間選擇為25 min。

2.1.2 液料比對芥菜總黃酮提取率的影響

液料比對總黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 液料比對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effects of liquid-to-material ratio on the extraction yield of total flavonoids

從圖2中可知，隨著溶劑增多，芥菜總黃酮提取率不斷增大，在液料比為 30∶1（mL/g）時達到最大，繼續增大液料比，總黃酮提取率反而下降，這是因為當溶劑較少時，芥菜顆粒無法被溶劑充分浸潤，總黃酮提取率較低，但溶劑增多時，后續濃縮過程會增加總黃酮的損失[14]，使得總黃酮的提取率反而降低。因此最佳液料比選擇為 30∶1（mL/g）。

2.1.3 乙醇濃度對芥菜總黃酮提取率的影響

乙醇濃度對總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids

從圖3中可知，隨著乙醇濃度的增大，芥菜總黃酮提取率不斷增大，在乙醇濃度為75%時達到最大，繼續增大乙醇濃度，總黃酮提取率反而下降，這是因為當乙醇濃度較低時，提取系統極性較大，部分極性較小的黃酮類物質無法溶出，總黃酮提取率較低，但乙醇濃度太高時，芥菜顆粒中一些極性較小的脂溶、醇溶性雜質也一并溶出，并與總黃酮產生溶出競爭[15]，使得總黃酮的提取率反而降低。因此最佳乙醇濃度選擇為75%。

2.1.4 超聲溫度對芥菜總黃酮提取率的影響

超聲溫度對總黃酮提取率的影響見圖4。

圖4 超聲溫度對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the extraction yield of total flavonoids

從圖4中可知，隨著超聲溫度的升高，芥菜總黃酮提取率不斷增大，在超聲溫度為70℃時達到最大，繼續升高超聲溫度，總黃酮提取率反而下降，這是因為當超聲溫度較低時，提取系統的分子熱運動較小，乙醇溶液與芥菜顆粒內物質的接觸與碰撞頻率較小，總黃酮提取率較低，但超聲溫度過高時，總黃酮中部分耐熱性較差的分子會發生氧化或斷裂[16]，使得總黃酮的提取率反而降低。因此最佳超聲溫度選擇為70℃。

2.2 響應面工藝優化

2.2.1 響應面試驗及分析方案

根據單因素試驗結果，利用Design-Expert 8.05b軟件對所考察的超聲時間、液料比、乙醇濃度和超聲溫度進行Box-Behnken試驗設計，結果見表2，方差及顯著性檢驗見表3。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface methodology

表3 方差及顯著性檢驗Table 3 Variance and significance test

利用Design-Expert 8.05b軟件對表2中的Box-Behnken試驗設計結果進行分析，得到芥菜總黃酮提取率（Y）與所考察的提取工藝之間的二次多項式回歸模型為：芥菜總黃酮提取率Y=26.71+0.22A-0.14B+0.71C+1.40D-0.84AB-0.088AC-1.06AD-0.25BC+0.49BD-1.04CD-1.34A2-1.89B2-1.22C2-2.57D2。

由表3的方差及顯著性檢驗分析可以看出回歸模型P＜0.000 1，說明該回歸模型差異極顯著；失擬度P=0.830 8＞0.05，不顯著，說明該回歸模型的預測值與試驗真實值之間的誤差小，擬合度較好；決定系數R2=0.936 5，說明該回歸模型具有較好的擬合度與可靠性，有超過93.65%的試驗真實值可以該回歸模型來預測與描述；根據F值及P值的大小分析，可以得到所考察的工藝條件對芥菜總黃酮提取率的影響順序為：D超聲溫度＞C乙醇濃度＞A超聲時間＞B液料比。其中對芥菜總黃酮影響極顯著（P＜0.01）的有一次項：乙醇濃度C、超聲溫度D、二次交互項：超聲時間與超聲溫度交互項AD；二次項：超聲時間A2、液料比B2、乙醇濃度C2、超聲溫度 D2；影響顯著（0.01＜P＜0.05）的有二次交互項：超聲時間與液料比AB、乙醇濃度與超聲溫度CD；影響不顯著（P＞0.05）的有一次項：超聲時間 A、液料比B、二次交互項：超聲時間與乙醇濃度AC、液料比與乙醇濃度BC、液料比與超聲溫度BD。說明所考察的超聲時間A、液料比B、乙醇濃度C和超聲溫度D與芥菜總黃酮提取率Y之間不是簡單的線性關系。綜上所述，該回歸模型誤差小，具有較高的擬合度和可靠性，可以用于芥菜總黃酮提取工藝的分析與預測。

2.2.2 因素交互作用分析

為進一步分析所考察的超聲時間、液料比、乙醇濃度和超聲溫度對芥菜總黃酮提取率的影響，固定所考察因素中的任意兩個因素，繪制出另兩個因素交互作用的響應面和等高線圖，如圖5所示。

圖5 各工藝因素交互作用對總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of interaction of various factors on the yield of total flavonoids

從響應面和等高線圖中可直觀的看出所考察的各工藝因素間交互作用，直觀反映工藝條件對響應值的影響。響應面的曲面坡度和等高線疏密程度可以反映工藝條件間交互作用的顯著強度，響應面曲面的坡度越陡，即傾斜度越高，等高線形狀越趨向橢圓，等高線密度越大，說明兩自變量之間的交互作用顯著。對圖5中的響應面和等高線圖進行分析可知，響應面曲面傾斜度最大，等高線密度最大的是超聲時間與超聲溫度交互作用圖，說明超聲時間與超聲溫度的交互作用對芥菜總黃酮提取率的影響最顯著；依次分析響應面曲面傾斜度和等高線密度可得各工藝因素間交互作用對芥菜總黃酮提取率的影響顯著順序依次為AD、CD、AB、BD、BC、AC。

2.2.3 最佳工藝及模型驗證

利用Design Expert 8.0.5b軟件對所得的二次多項式回歸模型進一步分析，得到芥菜總黃酮的最佳工藝條件為：超聲時間 24.94 min，液料比 29.91 ∶1（mL/g），乙醇濃度75.97%和超聲溫度71.16℃，在該提取工藝條件下，芥菜總黃酮提取率的預測值為26.94 mg/g，從試驗操作的便利性考慮，將提取工藝修正為超聲時間25 min，液料比 30∶1（mL/g），乙醇濃度 76%和超聲溫度71℃。根據修正后的工藝進行3次驗證試驗，測得芥菜總黃酮的提取率為26.82 mg/g，與最佳工藝的預測值（26.94 mg/g）相比，其相對誤差為0.45%，說明該二次多項式回歸模型準確率高、可靠性強，可用于芥菜總黃酮提取工藝的優化與預測。

2.3 芥菜總黃酮的脂質抗氧化活性

2.3.1 芥菜總黃酮對大豆油的抗氧化性能

維生素C和總黃酮對大豆油的抗氧化性能見圖6。

圖6 維生素C和總黃酮對大豆油的抗氧化性能Fig.6 Antioxidant properties of vitamin C and total flavonoids on soybean oil

從圖6中可知，在所考察的濃度范圍內，芥菜總黃酮對大豆油的抗氧化作用均有一定的效果，且隨著時間的延長，加入不同含量芥菜總黃酮的大豆油過氧化值（peroxide value，POV）值均增大，但均小于空白對照值，說明芥菜總黃酮對大豆油有一定作用，能起到抗氧化效果，且隨著總黃酮含量的增大，大豆油的POV值逐漸減小，說明總黃酮含量越高，對大豆油的抗氧化效果越好，當總黃酮含量為0.03%時，對大豆油的抗氧化效果超過0.02%的維生素C。

2.3.2 芥菜總黃酮對豬油抗氧化性能

維生素C和總黃酮對豬油的抗氧化性能見圖7。

圖7 維生素C和總黃酮對豬油的抗氧化性能Fig.7 Antioxidant properties of vitamin C and total flavonoids on lard

從圖7中可知，在所考察的濃度范圍內，芥菜總黃酮對豬油的抗氧化作用均有一定的效果，且隨著時間的延長，加入不同含量芥菜總黃酮的豬油POV均增大，但均小于空白對照值，說明芥菜總黃酮對豬油有一定作用，能起到抗氧化效果，且隨著總黃酮含量的增大，豬油的POV值逐漸減小，說明總黃酮含量越高，對豬油的抗氧化效果越好，當總黃酮含量為0.08%時，對豬油的抗氧化效果超過0.04%的維生素C。綜上分析芥菜總黃酮具有一定的脂質抗氧化性能，并與抗氧化活性呈現出量效關系，可作為添加劑添加到油脂產品中，以提高產品的貨架期。

3 結論

以芥菜為原料，在單因素試驗的基礎上結合響應面實驗設計得到芥菜總黃酮提取率與超聲時間、液料比、乙醇濃度和超聲溫度的二次多項式回歸模型，經驗證，該回歸模型擬合度好，誤差小，準確率高，能較好地對芥菜總黃酮的提取進行分析與預測。芥菜總黃酮的最佳提取工藝條件為超聲時間25min，液料比30∶1（mL/g），乙醇濃度76%、超聲溫度71℃，實際總黃酮提取率為26.82 mg/g，與理論預測值26.94 mg/g的相對誤差為0.45%，說明二次回歸模型擬合度好，誤差小，準確率高，適用于芥菜總黃酮提取工藝的優化。芥菜總黃酮對大豆油和豬油的抗氧化能力表明芥菜總黃酮具有一定的脂質抗氧化能力，與抗氧化活性呈現出量效關系，可作為添加劑添加到油脂產品中，以提高產品的貨架期。