石墨烯量子點熒光“開啟”適配體傳感器檢測卡那霉素

張磊，鄧健康，張富源

（1.天津科技大學食品科學與工程學院食品營養與安全國家重點實驗室，天津 300457；2.河南科技學院食品學院，河南 新鄉 453003；3.衡水學院生命科學學院，河北 衡水 053000；4.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071001）

卡那霉素（kanamycin，KAN）作為一種氨基糖苷類抗生素被廣泛用于人和牲畜，目的是治療細菌感染、乳腺炎、羊痘以及肺炎等[1-2]。然而，隨著KAN的長期過量使用，其危害逐漸顯現，如哺乳期動物乳汁污染、動物組織積累和細菌耐藥性等，進而對人體健康和環境安全造成威脅[3-4]。因此，非常需要開發一種簡單、快速和靈敏度高的新方法，用于定量檢測動物源性食品中痕量KAN殘留。目前，常用的檢測方法有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）[5]和液質聯用（high performance liquid chromatography with mass spectrometry，LC-MS）[6]，在定量和定性分析中具有明顯的優勢。但是，這些方法同時也存在耗時、樣品預處理復雜、儀器精密以及專業技術要求高等不足[7]。為克服這些缺陷，研究者進行了大量嘗試以開發用于KAN的快速且有效的檢測方法，包括：比色法（colo-rimetric assay，CA）[8]、熒光傳感器（fluoresence，FL）[2]和電化學生物傳感器（electrochemistry，EC）[9]等。其中，熒光傳感器由于具有制備簡單、易定量、高靈敏度以及高通量生物分析潛力等優點，已被廣泛用于化學和生物分析領域[10-11]。

近年來，氮摻雜石墨烯量子點（nitrogen-doped graphene quantum dots，N-GQDs）由于其量子產率更高和活性位點豐富而倍受關注。值得注意的是，N-GQDs通過控制其聚集/解離狀態，可以切換體系熒光淬滅/恢復[12]。因此，通過引入能誘導N-GQDs聚集/解離的特異性識別探針，可以制備一種具有高選擇性和優異靈敏度的新型熒光傳感器。核酸適配體（aptamers，Apt）是一小段經體外篩選得到的寡核苷酸序列，它不僅能與其互補鏈（complementary strand，CS）結合形成DNA雙螺旋結構，還能與其目標物進行更強的高親和力特異性結合，因此可以勝任這一角色[13]。

本研究提出了一種新型熒光“開啟”策略，用于高靈敏度檢測動物源性食品中的卡那霉素（KAN）。其原理是基于不同狀態的適配體結構轉換（Apt-CS/Apttarget）誘導N-GQDs聚集狀態發生改變（聚集/解聚），并最終引起體系熒光信號的淬滅/恢復，原理如圖1所示。通過這一策略，可以進行KAN的檢測，并能作為原型擴展到其它目標物的檢測。

圖1 構建適配體傳感器原理圖Fig.1 Schematic diagram of the designed aptasensor

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

KAN-Apt及其 3條互補鏈（CS）：Genewiz（蘇州）公司 [堿基序列如下：KAN-Apt：5′-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-（CH2）7-NH2-3′；互補鏈：包括 CS1（5′-NH2-（CH2）6-TCGGCTTAG-3′）、CS2（5′-NH2-（CH2）6-TCGGCTTAGCC-3′） 和 CS3 （5′-NH2-（CH2）6-TCGGCTTAGCCTC-3′）]；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺[1-Ethyl-3-（3-（dimethylamino）propyl）carbodiimide，EDC]、N-羥基琥珀酰亞胺酯（N-hydroxysuccinimide ester，NHS）：美國 Sigma-Aldrich 公司；檸檬酸（citric acid，CA）：加拿大 BioBasic公司；三（羥甲基）氨基甲烷[Tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris-HMA]、卡那霉素（KAN）：阿拉丁（上海）有限公司。以上試劑均為分析純。

透射電子顯微鏡（2010 FEF）：日本JEOL公司；UV-Vis紫外可見分光光度計（Cary 50-Bio）：美國Varian公司；熒光分光光度儀（Thermo Lumina）：美國Thermo公司；傅立葉變換紅外光譜儀（Vector-22）：德國Bruker公司。

1.2 N-GQDs、N-GQDs-Apt和 N-GQDs-CS 的制備

N-GQDs采用CA和Tris-HMA混合物一步熱解法制成[14]。得到的N-GQDs溶液通過冷凍干燥24 h得到淡黃色粉末，棕色瓶中4℃保存。N-GQDs-Apt和N-GQDs-CS采用碳二亞胺化學縮合方法合成[12]。首先，取 10 mL N-GQDs懸浮液（0.4 mg/mL），加入 30 μL EDC（19 mg）和 NHS（22 mg）混合液，混合 30 min。然后，將混合液平均分成兩份，每份分別與24 μL氨基修飾的 KAN-Apt或 CS 溶液（100 μmol/L）混合 2 h，通過縮合反應分別得到N-GQDs-Apt和N-GQDs-CS。接著超濾以除去過量的Apt/CS。最后，超濾過的復合物洗滌3次，分散于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），4℃保存。通過添加過量的KAN-Apt和CS，使N-GQDs完全反應，確保體系中N-GQDs之間最大程度聚集[12]。

1.3 構建檢測體系

取500 μL N-GQDs-Apt，加入等體積N-GQDs-CS，20℃輕微攪拌10 min，通過簡單混合，構建NGQDs-Apt/N-GQDs-CS適配體傳感器。通過優化緩沖溶液pH值、N-GQDs濃度、CS序列長度、Apt與CS結合的孵育溫度和時間、KAN與Apt特異性結合的反應溫度和時間等參數進行優化，獲得高靈敏度的熒光“開啟”適配體傳感器。

1.4 KAN測定

加入不同濃度的KAN，在330 nm激發波長下，記錄測定檢測體系（N-GQDs-Apt/N-GQDs-CS）的熒光光譜和熒光強度。具體而言，首先將50 μL不同濃度的KAN、150 μL N-GQDs-Apt/N-GQDs-CS 混合溶液和300 μL PBS溶液（pH 7.4）快速混合，20℃振蕩孵育15 min。接著，用λex=330 nm測量檢測體系熒光強度，并記錄其熒光光譜。最后，基于以上結果創建標準曲線。此外，采用50 μL預處理樣品或加標樣品代替標準溶液進行分析，根據工作曲線計算實際樣品中KAN濃度。

1.5 實際樣品準備

所用動物源性食品樣品均從當地超市購買。

熒光測定，對樣品進行處理以去除蛋白質和脂肪。牛奶和蜂蜜樣品采用三氯乙酸進行預處理[15]。除每次離心前需要冰水浴超聲10 min外，魚肉、雞肉和雞蛋的預處理方法與牛奶和蜂蜜樣品處理方法基本相同。另外，在提取前，需要將它們分別搗碎、攪拌10 min得到均勻粉碎樣品。在測量之前，將濾液避光4℃保存。

樣品中加入 KAN 標準溶液（0.2、1.0、2.5 ng/mL），采用牛奶和蜂蜜處理方法對加標樣品進行預處理并分析。

6個收集的實際樣品中加入KAN標準溶液（0.2、1.0、2.5 ng/mL），采用牛奶和蜂蜜處理方法對加標樣品進行預處理，得到加標樣品的上清液。之后，根據本研究方法分析所得加標樣品，根據各樣品基質標準曲線計算各加標樣品中KAN含量。

2 結果與分析

2.1 N-GQDs、N-GQDs-Apt和 N-GQDs-CS 的制備和表征

為驗證N-GQDs-Apt、N-GQDs-CS的形態以及粒度分布，對它們進行透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）表征。結果如圖2。

圖2 所制備材料的TEM圖和粒徑分布Fig.2 TEM image and particle size statistics of the prepared materials

由圖2a、圖2b可知，所制備的N-GQDs-Apt/CS穩定且分散良好。由圖2e、圖2f可知，N-GQDs-Apt的直徑主要在3.9 nm～5.4 nm之間，平均粒徑為4.56 nm，NGQDs-CS在3.6 nm～5.1 nm之間，平均粒徑為4.41 nm。比較發現，兩者粒徑有細微差別，前者的平均粒徑比后者稍大。此外，還對添加KAN前后的檢測體系進行了TEM表征。由圖2c可知，N-GQDs-Apt/N-GQDs-CS混合物導致N-GQDs顯著聚集，表明Apt和CS有效雜交；由圖2d可知，將KAN添加到N-GQDs-Apt/NGQDs-CS混合體系后，發現大量N-GQDs顯著分散，表明加入KAN后阻礙了Apt和CS的雜交。

為驗證N-GQDs和N-GQDs-Apt/CS的成功合成，對3種材料進行紫外-可見吸收光譜檢測，結果如圖3所示。

圖3 N-GQDs、N-GQDs-Apt、N-GQDs-CS 和混合體系紫外-可見吸收光譜Fig.3 UV-vis spectra of N-GQDs，N-GQDs-Apt/CS and the mixture system

結果顯示，N-GQDs-Apt與N-GQDs-CS除了具有N-GQDs的特征峰[在235 nm處的肩峰（C=C鍵的ππ*躍遷）和335 nm處明顯的紫外吸收峰（sp3團簇中均勻的分布有sp2團簇）[14]外，在260 nm處出現了一個新的ssDNA特征峰，這證明了N-GQDs與Apt/CS的成功偶合。另外，還對N-GQDs-Apt/N-GQDs-CS混合體系的紫外-可見吸收光譜進行了測定。結果發現，與單個組分相比，N-GQDs-Apt/N-GQDs-CS混合物的紫外-可見吸收光譜沒有明顯變化。

通過對N-GQDs和N-GQDs-Apt進行傅立葉變換紅外光譜（fourier transform infrared spectrum，FTIR）表征，以獲得其化學和結構信息，結果見圖4。

圖4 傅立葉紅外光譜光譜圖Fig.4 Fourier transform infrared spectroscopy

由圖4a可知，在N-GQDs的FTIR光譜圖中，明顯存在-OH、-NH和-COO-的伸縮振動峰，以及C-O拉伸和C-H彎曲的振動峰[16-18]。C=O振動和C=C拉伸峰表明合成的N-GQDs含有能提高水溶性的羰基[18]，C=C的伸縮振動峰表明其具有石墨烯六元環晶格結構[14]。這些特征峰證實了本研究中N-GQDs的成功合成。此外，C-NH-C和-NH的伸縮振動峰則表明合成的N-GQDs成功引入了氮摻雜[19]。另外，由圖4b可知，當引入KAN-Apt時，出現了4個新的振動峰：1 064.7 cm-1和1 132.2 cm-1處的峰歸因于2-脫氧核糖中C-O-C的不對稱拉伸和對稱磷酸鹽（PO2-）的振動；983.6 cm-1和802.3 cm-1處的峰歸因于Apt中P=O和P-O的伸縮振動。基于這些特征，表明N-GQDs與Apt實現了成功偶聯[20-21]。

為探究N-GQDs、N-GQDs-Apt/CS以及添加KAN前后檢測體系的光學特性，對它們的熒光光譜進行分析，如圖5所示。

圖5 熒光光譜分析Fig.5 Fluorescence spectral analysis

由圖 5a可知，N-GQDs-Apt/CS 在 λex/λem=330 nm/445 nm處具有最強的熒光信號，而兩者混合體系的發射光譜發生了明顯的熒光淬滅，熒光強度大幅下降67.8%以上，并且，它還發生了8 nm的紅移（λex/λem=330 nm/453 nm）。更有趣的是，隨著體系中加入KAN（50 ng/mL），其發射光譜的紅移又會隨著熒光恢復而逐漸消失。

同時，將N-GQDs-Apt與N-GQDs混合作為對照組，以測量體系FL強度的變化。由圖5b可知，對照組沒有發生明顯的熒光淬滅。此外，加入KAN后觀察到對照組的FL強度幾乎也沒有變化。這充分表明熒光淬滅是由Apt和CS雜交進而引起N-GQDs聚集而導致的。

2.2 N-GQDs聚集引起體系熒光淬滅的原理

基于上述對 N-GQDs、N-GQDs-Apt、N-GQDs-CS和N-GQDs-Apt/N-GQDs-CS檢測體系的表征，研究了該方法的機理。添加KAN前，Apt-CS雜交會誘導N-GQDs聚集（圖2c），從而導致體系熒光明顯淬滅。同時，體系熒光發射光譜發生紅移，而吸光度沒有變化。基于這些結果，證明發生了有效的激子能量轉移[12]。相反，體系中添加KAN（50 ng/mL）后，它與N-GQDs-Apt之間的特異性識別和結合引起Apt的結構轉換。這限制了Apt-CS的雜交，導致N-GQDs解聚（圖2d），并削弱了N-GQDs之間的激子能量轉移，最后體系FL強度得以顯著恢復。

2.3 條件優化

據研究，KAN熒光測定受試驗條件的影響非常明顯。為獲得靈敏度更高的熒光適配體傳感器，本研究對包括緩沖溶液pH值、N-GQDs濃度、CS序列長度、Apt與CS結合的孵育溫度和時間、目標物與Apt特異性識別的反應溫度和時間等參數進行了優化。基于優化結果，最終選取最佳條件為：pH 7.4、CS2（11 bp）、CN-GQDs=0.4 mg/mL、20℃孵育10 min，加入KAN后，20℃反應15 min。最后，測定體系FL強度，根據標準曲線計算KAN含量。

2.4 KAN檢測和繪制校準曲線

在最佳條件下，分析不同KAN濃度下構建的適配體傳感器的熒光光譜，如圖6所示。

圖6 不同KAN濃度下構建的適配體傳感器的熒光光譜分析Fig.6 Fluorescence spectrum analysis of aptamer sensors constructed at different Kan concentrations

所制備的傳感器的熒光強度變化和KAN濃度在0.1ng/mL～10.0ng/mL范圍內保持線性關系。校準曲線可用公式（F-F0）/F0=0.1382C[KAN]+0.0015表示，相關系數為0.999 2。檢測限（limit of detection，LOD）為0.036 ng/mL。

2.5 選擇性

通常畜牧生產過程中會使用多種抗生素，所以會導致動物性產品中多種抗生素的殘留[1]。因此，應研究常見抗生素共存下本方法的靶標特異性，以消除其它常見抗生素的潛在干擾。本試驗研究了在氨基糖苷類抗生素和其它主要抗生素共存下體系的熒光特性，結果見圖7。

圖7 N-GQDs-Apt/N-GQDs-CS對KAN共存物的選擇性Fig.7 Selectivity of N-GQDs-Apt/N-GQDs-CS for

由圖7a可知，僅有KAN引起體系熒光強度的顯著變化（36.5%）。其它常見的抗生素無明顯作用（＜5%）。結果表明，所開發的體系對KAN的選擇性明顯高于其它常見抗生素。

為進一步研究其它抗生素對體系的影響，將其中兩種氨基糖苷類抗生素，慶大霉素（gentimicin，GEN）和硫酸鏈霉素（streptomycin sulphate，STR）以及常見的氨芐西林（ampicillin，AMP）進行競爭性試驗。由圖7b可知，在同時添加5倍濃度上述3種抗生素的情況下，與僅添加KAN的體系相比，未觀察到體系熒光回收率有顯著差異。可以看出，該結果主要歸因于所構建的熒光適配體傳感器中適配體與KAN的特異性結合，而與非特異性結合無關。因此，開發的傳感器具有很高的選擇性優勢，為復雜基質樣品中KAN的檢測提供了一種新的有效方法。

2.6 方法精密度

本研究中，對 3個濃度（0.2、1.0、2.5 ng/mL）的KAN標準溶液分別在不同時間進行熒光檢測，以評價本方法的穩定性。通過對同一樣品進行日內和日間重復熒光檢測，得到本方法的日內和日間精密度。結果表明，本方法的日內和日間相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）（n=6） 較小，分別為 0.5%～2.3%和0.9%～4.0%。因此，該方法非常適于痕量KAN的檢測，結果見表1。

表1 方法的日內和日間精密度（n=6）Table 1 The intra-and inter-day precisions of the assay（n=6）

2.7 實際樣品分析

動物源性實際樣品中含有一定濃度的氨基酸、糖類和金屬離子等成分，它們可能會對KAN檢測結果產生影響。本研究對上述各類共存物進行了干擾試驗，以驗證本研究方法對動物源性食品樣品的適用性。主要包括兩部分內容：第一，通過單獨添加共存物或KAN，比較它們對體系熒光強度的影響；第二，通過同時添加目標物和上述各共存物，比較共存物對體系熒光恢復效率的影響。各共存物對體系熒光強度的影響見圖8。

圖8 干擾試驗Fig.8 Interference experiment

由圖8a可知，單獨添加各共存物對體系熒光均無顯著影響；由圖8b可知，同時添加各共存物和KAN時，體系熒光的恢復程度也與單獨添加KAN時相當（KAN、各種氨基酸和糖類濃度為2.5 ng/mL，金屬離子濃度為KAN濃度的10倍）。結果表明，各氨基酸、糖類和金屬離子等主要共存物對檢測體系用于KAN檢測并無顯著干擾。

本研究還通過多個濃度加標樣品檢測，繪制了基質標準曲線，并計算了各樣品的檢出限。結果如圖9。

圖9 加標樣品中熒光強度變化（F/F0-1）與KAN濃度的線性校準曲線Fig.9 The linear calibration of the fluorescence intensity variation（F/F0-1）versus KAN concentration in spiked samples

由圖9可知，5種動物源性食品樣品均表現出較低的檢出限（0.044 ng/mL～0.074 ng/mL）。所以，上述干擾試驗、基質標準曲線和樣品檢出限的結果很好地證明了本研究所構建體系對動物源性食品樣品中KAN痕量檢測的適用性。

此外，本研究還對6個未知實際樣品[牛奶、魚（2個）、雞肉、雞蛋、蜂蜜]進行加標回收試驗，以此驗證本方法的適用性和準確性。結果如表2所示。

表2 實際樣品中KAN的檢測（n=3，pH 8.0）Table 2 Analytical results for KAN detecting in actual samples（n=3，pH 8.0）

由表2可知，一個魚肉樣品（0.11 ng/mL）和另一蜂蜜樣品（0.16ng/mL）中檢測出痕量KAN殘留物，但是它們都遠低于允許的最大殘留量（150ng/mL～200ng/mL）。其它樣品的結果則均為陰性。結果顯示，各不同濃度加標樣品的測量值與KAN添加量保持一致，定量回收率在96.5%～106.9%之間，相對標準偏差（RSD）小于4.0%。鑒于以上結果，證明了該方法具有良好的準確性和可重復性，能用于動物源性食品中KAN檢測。

另外，還對本方法與已發表的方法進行了比較，結果如表3所示。

表3 不同KAN測定方法的比較Table 3 Comparison of different methods for the determination of KAN

比較發現，本研究方法具有優于同類型熒光適配體方法的優勢，而與其它方法相當。值得注意的是，基于其極為簡單的反應過程，本研究方法（包含樣品提取過程在內）的整個測試過程可在45 min內完成，因此更加方便有效。總之，這些結果表明，本研究中開發的基于N-GQDs-Apt結構轉換誘導N-GQDs聚集/解聚的熒光“開啟”適配體傳感器具有在動物源性食品等復雜基質樣品中高靈敏度快速檢測KAN的潛在適用性。

3 結論

本研究開發了一種新型的基于Apt結構轉換的熒光“開啟”適配體傳感器，該傳感器能誘導N-GQDs的聚集/解離行為。它被證明適用于動物源性食品中卡那霉素（KAN）的高靈敏度和高效檢測。與以前的方法相比，所提出的策略具有以下優點：首先，Apt的結構轉換誘導N-GQDs的聚集/分解行為，使體系具有更高的靈敏度和出色的選擇性；其次，構建的N-GQDs-Apt/N-GQDs-CS檢測體系具有簡單、快速的特點；最后，它成功用于檢測復雜基質樣品中的KAN。總之，本研究中構建的適配體傳感器顯示出許多突出的優點，包括易于制備、效率高、靈敏度高、特異性好和成本低等。這為分析復雜基質樣品中的痕量目標物提供了一種新的有效策略。