可降解咖啡堿的酵母菌菌種篩選及其培養條件的優化

余佳熹，張佳琪，何貴平，鄧莎，呂遠平，2*

（1.四川大學輕工科學與工程學院，四川 成都 610065；2.四川大學健康食品科學評價體系研究中心，四川 成都 610065）

咖啡堿又名 1，3，7-三甲基-2，6-二氧嘌呤，是一種普遍存在于植物中的嘌呤類生物堿物質[1]，多從咖啡果[2]、可可豆[3]、可拉果、茶葉[4]等中提取而得。咖啡堿是一種中樞神經興奮劑，人們獲取咖啡堿的產品包括咖啡、能量飲料、藥丸、茶水和蘇打水[5]。然而，咖啡堿的使用可能會影響健康狀況[6]，有研究表明高劑量地攝入咖啡堿會降低睡眠效率[7]，引起焦慮[8]、頭疼、心血管疾病[9]，甚至胎兒畸形[10]、孕期婦女流產[11]、青少年鈣流失[12]、運動功能受損[13-15]等不良影響，過度攝入咖啡堿還會影響人體對鐵的吸收，從而造成貧血[16]。因此，低咖啡堿制品越來越受到消費者的歡迎。

目前主要的脫除咖啡堿的方法有水脫除法[17]、吸附分離法[18]、溶劑萃取法、超臨界CO2萃取法[19]以及微生物法等。但前幾種方法耗時費力且咖啡堿降解率不高，還會對環境造成一定程度的污染，而微生物法以安全無毒、降解效率高的優點獲得了越來越多學者的青睞。國內外專家經研究發現細菌類的假單胞菌以及真菌類的曲霉菌降解咖啡堿的效果較好，但大多都不能直接應用于食品當中。因此本試驗從茶葉基地土壤中篩選純化出一株具有咖啡堿降解能力的酵母菌株，對其進行鑒定分析，并通過優化降解條件的方式提高其降解咖啡堿的能力，以期獲得一株可應用于食品行業的具有脫除咖啡堿能力的菌株。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

本試驗中所用的土壤由貴州省畢節市金沙縣茶葉種植基地提供；咖啡堿標準品：Sigma公司；MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、KH2PO4（均為分析純）：成都科隆化學品有限公司；YPD培養基：北京奧博星生物技術有限公司。

內轉錄間隔區序列（internal transcriptional spacer sequence，ITS）測定委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 主要儀器與設備

高溫高壓蒸汽滅菌鍋（YXQ-30SI）：上海博訊實業有限公司；高效液相色譜儀（1260InfinityⅡ，配有7890A自動進樣氣相色譜儀）：安捷倫科技有限公司；恒溫培養箱（MJ-250）：上海一恒科學儀器有限公司；光吸收型酶標儀（SPECTRA MAX190）：美國分子儀器公司。

1.3 培養基配方

培養基配制方法如表1所示。

表1 培養基的配制Table 1 Culture medium

1.4 方法

1.4.1 可降解咖啡堿菌株的篩選與鑒定

1.4.1.1 菌株的篩選

以植株根系附近的土壤為媒介，經3次富集培養后，稀釋富集液，配成不同濃度的菌懸液。將菌懸液涂布于固體篩選培養基中，30℃恒溫條件下培養72 h，選取固體篩選培養基中的單菌落，并經多次平板劃線將其分離純化。

1.4.1.2 菌株的鑒定

通過菌落形態觀察、細胞形態記錄以及對ITS進行DNA測序，鑒定菌株的種屬情況。

1.4.2 生長曲線的測定

取活化后的菌株，以2%（體積分數）的接種量接種至降解培養基中，在30℃，120 r/min的條件下振蕩培養4 d，每隔6 h在600 nm下檢測菌液濃度。

1.4.3 咖啡堿降解率測定

高效液相色譜條件[20]：色譜柱：Poroshell 120 ECC18（4.6mm×150mm，4μm）；柱溫：30℃；流速：1mL/min；檢測波長285 nm；進樣量10 μL；流動相A：0.5%甲酸水溶液，B：甲醇，梯度洗脫，洗脫程序如表2所示。

表2 高效液相色譜條件Table 2 Gradient operation in HPLC

咖啡堿降解率計算方法見公式（1）。

1.4.4 降解條件對咖啡堿降解率的影響

1.4.4.1 單因素試驗

將活化后的菌種（活菌數為1×108CFU/mL）培養28 h后，分別以溫度（20、24、28、32、37℃），菌種添加量（2%、4%、6%、8%、10%），發酵時間（12 h～72 h，每隔 4 h取樣測定），搖床速度（100、120、140、160、180 r/min），咖啡堿添加量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL）為因素設計單因素試驗，其它條件分別固定為咖啡堿添加量0.5 mg/mL、菌種添加量4%、搖床速度140 r/min、溫度28℃，以咖啡堿降解率為指標探究菌種降解咖啡堿的條件。

1.4.4.2 響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，選取溫度、菌種添加量、發酵時間、咖啡堿添加量4個因素，以咖啡堿降解率為評價指標，對菌種降解咖啡堿的工藝進行優化，因素水平見表3。使用Design Expert 11軟件進行數據分析。

表3 響應面試驗因素水平Table 3 Factors and levels of response surface experiments

2 結果與分析

2.1 可降解咖啡堿菌株的篩選與鑒定

經分離和純化，得到一株可降解咖啡堿的菌種，命名為Y-1。Y-1菌株在YPD培養基上的形態如圖1所示。

圖1 Y-1菌形態觀察圖Fig.1 Morphological observation of Y-1 bacteria

該菌的單個菌落呈圓形，菌落較大較厚，為乳白色，表面濕潤且黏稠，容易被挑起。由圖1（B）Y-1菌株在40倍光學顯微鏡下的細胞形態，可觀察到視野中細胞呈圓形或橢圓形，且較大的母體細胞旁有芽體存在。

根據基因序列，使用MEGAX 10.1.8軟件構建系統發育樹，如圖2所示。

圖2 Y-1菌株系統發育樹Fig.2 The phylogenetic tree of strain Y-1

結果表明Y-1菌株與Saccharomyces cerevisiae（釀酒酵母）同源性最高。經形態學和ITS基因測序與系統發育樹構建，可以確定菌株Y-1屬于酵母菌屬。

2.2 生長狀況與降解能力分析

釀酒酵母Y-1菌株在含有1 mg/mL咖啡堿的降解培養基中生長，生長狀況如圖3所示。

圖3 Y-1菌種在液體篩選培養基中的生長情況Fig.3 Growth of Y-1 strain in liquid screening medium

釀酒酵母通常在5 h～12 h內就會進入對數生長期快速生長，釀酒酵母Y-1菌株在含有1 mg/mL咖啡堿的降解培養基中遲滯期延長到了22h，說明咖啡堿的存在對釀酒酵母Y-1菌株的生長有抑制作用。在30℃培養22 h后，菌體細胞密度（OD600）迅速上升，開始進入對數生長期，并在42 h時OD600值達到了0.600 2±0.023。

2.3 降解條件對菌種生長和咖啡堿降解率的影響

2.3.1 單因素試驗結果

單因素試驗結果見圖4。

圖4 培養條件對咖啡堿降解率的影響Fig.4 Effects of culture conditions on theine degradation rate

從圖4（A）中可知，咖啡堿降解率隨時間的增加呈“S形”曲線式增加。在培養的20 h～36 h內，釀酒酵母Y-1菌株迅速代謝咖啡堿，并在第36小時達到了（39.06±2.38）%。36 h后咖啡堿的降解速率趨緩，52 h后咖啡堿降解率趨于穩定，在72 h時咖啡堿降解率為（45.85±1.52）%。

由 4（B）可知，釀酒酵母 Y-1 菌株在 32、28、24 ℃的培養條件下，降解咖啡堿的能力較好。釀酒酵母是兼性厭氧菌，在氧氣存在的環境下進行有氧呼吸，大量繁殖，將葡萄糖分解為二氧化碳和水，并產生大量能量；在氧氣不足的情況下進行無氧呼吸，產生乙醇、水和少量能量。搖床的速度主要影響的是培養液中氧氣的含量。從圖4（C）可知，搖床速度對釀酒酵母Y-1菌株利用咖啡堿進行代謝的影響較小，雖然咖啡堿的降解率隨搖床速度的增加而增加，但各個速度之間的咖啡堿降解率差別不明顯。

由4（D）可知，當菌種添加量為10%時，培養的前20 h內咖啡堿的降解率都高于其它菌種添加量，但在20 h后其降解速率趨于平緩，并逐漸低于其它菌種添加量。產生這種現象的原因可能是由于環境營養有限，大量的釀酒酵母Y-1菌株過快地消耗了營養物質，使得環境內菌株的衰亡期提前到來，最終影響了咖啡堿的降解率。當菌種添加量為6%時，咖啡堿的降解率最高，其次是4%和8%的菌種添加量，因此可選擇4%～8%作為較佳的菌種添加量。

由圖4（E）可知，當咖啡堿添加量高于2 mg/mL時，釀酒酵母Y-1菌株對咖啡堿的利用率迅速下降，這可能是因為較高濃度的咖啡堿抑制了菌株的生長。釀酒酵母Y-1菌株在咖啡堿添加量為0.5 mg/mL～1.5 mg/mL時降解咖啡堿的能力較好，可以用于脫除茶葉中的咖啡堿。

2.3.2 響應面試驗結果

Box-Behnken試驗設計結果如表4所示。

表4 Box-Behnken試驗設計及結果Table 4 Results of response surface experiments

續表4 Box-Behnken試驗設計及結果Continue table 4 Results of response surface experiments

非線性回歸二次多項式擬合分析得到咖啡堿降解率與各個因素間的回歸方程：Y=47.56+3.88A+0.805 8B+3.22C-8.36D+1.08AB-1.02AC-3.08AD+0.122 5BC+0.330 0BD-2.20CD-2.06A2-4.38B2-0.722 9C2-1.24D2。

方差分析結果見表5。

表5 回歸方程方差分析結果Table 5 Analysis results of regression and variance

由表5可知，該模型回歸性極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.860 3＞0.05），說明模型在回歸區域內的擬合度較高，實測值與預測值之間的相關性良好。回歸方程中的一次項A、B、C、D都極顯著，交互項AD、CD以及二次項A2、B2、D2也均達到了極顯著水平，這表明各因素對響應值的影響不是呈簡單的線性關系的。各因素對酵母菌Y-1降解咖啡堿的影響程度大小順序為：咖啡堿添加量＞溫度＞發酵時間＞菌種添加量。

各因素交互作用對咖啡堿降解率影響的響應面圖見圖5。

圖5 各因素交互作用對咖啡堿降解率影響的響應面圖Fig.5 Response surface plot and contour map showing the interactive effects of two factors on decaffeination rate

采用Design Expert 11軟件對數據進行優化預測，選擇咖啡堿降解率最大值為排序條件，模型預測出的最優條件為：發酵溫度30.673℃、發酵時間46.636 h，咖啡堿添加量0.530 mg/mL、菌種添加量6.906%，此條件下咖啡堿降解率為59.800%。結合試驗中實際操作的可能性，將參數調整為：發酵溫度31.00℃、發酵時間46.60 h，咖啡堿添加量0.50 mg/mL、菌種添加量6.90%。在修正參數的條件下進行3次平行試驗，咖啡堿降解率為（59.39±0.28）%，與預測值相比，相對誤差為（1.06±0.28）%。

3 結論

從茶葉種植基地的土壤中分離得到一株可降解咖啡堿的真菌，命名為Y-1，經過對其表型特征分析、ITS測序分析以及系統發育樹分析鑒定為釀酒酵母的同源菌。以咖啡堿降解率為指標，通過單因素試驗和響應面試驗得到最佳培養條件為：發酵溫度31.00℃、發酵時間46.60 h，咖啡堿添加量0.50 mg/mL、菌種添加量6.90%。在此條件下，菌株Y-1在培養基中的咖啡堿降解率最高可達（59.39±0.28）%。將其應用于食品行業生產茶酒飲料，可以有效去除產品中的咖啡堿，對低咖啡堿產品的開發具有重要意義。