啤酒酵母高級醇的代謝與調控研究進展

馮鵬鵬，孫麗靜，肖冬光，謝鑫，宋富，張翠英*

（1.省部共建食品營養與安全國家重點實驗室，工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.北京燕京啤酒股份有限公司技術中心，啤酒釀造技術北京市重點實驗室，北京 101300）

在啤酒釀造過程中，啤酒酵母除產生主要代謝產物乙醇外，還會產生酸類、酯類、高級醇類、醛類、酚類等風味物質[1]。而高級醇是最重要的風味物質之一，主要包括正丙醇、異丁醇、異戊醇、活性戊醇和苯乙醇等。

啤酒中高級醇的含量一般為70 mg/L～100 mg/L，而部分優質的清爽型啤酒中高級醇含量能夠控制在50 mg/L～90 mg/L[2]。高級醇含量過低，會使酒體不豐滿，口感較差，但其含量過高，不僅影響酒體的協調性，還會對飲用者的身體產生明顯的副作用。所以在啤酒的釀造過程中，如何把高級醇的含量控制在一個合理范圍之內，是一個非常關鍵的問題。

1 啤酒酵母高級醇代謝途徑

在啤酒酵母中，α-酮酸脫羧成醛后再被還原可以生成相應的高級醇。一般而言，根據α-酮酸來源方式的不同，將酵母生成高級醇的途徑分為分解代謝途徑（Ehrlich途徑）和糖代謝途徑（Harris途徑）。

1.1 分解代謝途徑（Ehrlich途徑）

1907年，德國化學家Ehrlich首先提出由氨基酸可以生成高級醇，即所謂的Ehrlich途徑，如圖1所示。

圖1 Ehrlich途徑Fig.1 Ehrlich pathway

啤酒酵母在利用糖類生成酒精的過程中，由蛋白質分解而來的氨基酸在轉氨酶催化下生成相應的α-酮酸和谷氨酸，α-酮酸經脫羧酶和脫氫酶的作用轉化為各種高級醇。研究發現，發酵液中的異丁醇、異戊醇、活性戊醇有大約25%來源于此途徑[3]。在此途徑下，纈氨酸生成異丁醇，亮氨酸生成異戊醇，苯丙氨酸生成苯乙醇，異亮氨酸生成活性戊醇[4]

1.2 糖代謝途徑（Harris途徑）

1953年，Harris提出高級醇可在葡萄糖經糖代謝合成氨基酸的過程中生成，如圖2所示。

圖2 糖代謝途徑（Harris途徑）Fig.2 Metabolism pathway of carbohydrate（Harris pathway）

葡萄糖先后經過糖酵解途徑、三羧酸循環生成的α-酮酸可以和NH3作用生成氨基酸，同時也可以在酮酸脫羧酶、脫氫酶的作用下生成高級醇。

2 高級醇代謝調控機理及關鍵基因

啤酒中的高級醇既可來源于Ehrlich途徑，又可由糖代謝途徑生成。當啤酒酵母在發酵過程中氨基酸含量十分豐富時，便會通過Ehrlich途徑生成高級醇，主要包括酪醇、色醇、苯乙醇等10種高級醇的生成，相反，當某種必需氨基酸不足時，酵母會通過糖代謝途徑合成氨基酸來滿足自身生長需求，若此過程中氮源不足，糖代謝中間產物α-酮酸就會由于不能轉變為相應氨基酸而積累，并在α-酮酸脫羧酶及醇脫氫酶的作用下生成高級醇，最重要的便是支鏈氨基酸的從頭合成途徑[5]。主要高級醇生成途徑如圖3所示。大致可以分為上下游兩部分。上游途徑：氨基酸/丙酮酸到α-酮酸；下游途徑：α-酮酸脫羧還原為對應的高級醇。

圖3 高級醇代謝途徑Fig.3 Metabolism pathway of higher alcohol

2.1 異丁醇途徑及關鍵基因

異丁醇可以由纈氨酸分解而成（Ehrlich途徑）。即纈氨酸經胞質支鏈氨基酸轉氨酶（BAT2基因編碼）作用轉氨為 α-酮異戊酸（α-ketoisovalerate，KIV），隨后KIV在酮酸脫羧酶（2-keto-acid decarboxylase，KDCs）、乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADHs）催化下脫羧還原為異丁醇。同樣，異丁醇也可由糖代謝途徑生成。兩分子糖酵解而來的丙酮酸在乙酰乳酸合成酶（ILV2基因編碼）的作用下縮合為2-乙酰乳酸（2-acetyl lactate，ALAC）和二氧化碳，乙酰羥酸還原酶（ILV5基因編碼）將 ALAC 還原為 2，3-二羥基異戊酸（2，3-dihydroxyisovalerate，DIV）后再經二羥基酸脫水酶（ILV3基因編碼）作用脫水為KIV，生成的KIV可以在支鏈氨基酸氨基轉移酶（BAT1基因編碼）的催化下轉化為纈氨酸，也可以經酮酸脫羧酶（ketonic acid decarboxylase，KDCs）和乙醇脫氫酶（ADHs）的催化生成高級醇。共同的中間產物KIV將異丁醇生成的兩種途徑相偶聯，依據酵母需求生產高級醇[6]。

參與異丁醇合成過程中的關鍵酶有支鏈氨基酸滲透酶（BAP2基因編碼）、支鏈氨基酸轉氨酶（branched-chain amino acid transaminase，BCATs）、乙酰乳酸合成酶（ILV2基因編碼）、乙酰羥酸還原酶（ILV5基因編碼）及二羥基酸脫水酶（ILV3基因編碼）。分別負責支鏈氨基酸的攝取、降解及中間產物KIV的生成，所以它們的表達將影響異丁醇的產量。支鏈氨基酸轉氨酶（BCATs）位于線粒體（Bat1p）和胞漿（Bat2p）中，催化支鏈氨基酸（branched-chain amino acid，BCAAs）的轉氨反應，有研究表明BAT1基因傾向于催化氨基酸合成，而BAT2基因更傾向于氨基酸的降解[7]，這可能是由于它們所處環境的不同所造成的。HAMMER等[8]研究發現，在釀酒酵母中敲除BAT1基因后能顯著提高異丁醇的產量，特別是當培養基中不含纈氨酸時，可使異丁醇產量比出發菌株增加14.2倍。原因可能是敲除BAT1基因后KIV轉化為纈氨酸的能力減弱，KIV在線粒體中積累促進了異丁醇的產生。恰好這也進一步驗證了之前所說的BAT1基因更傾向于催化氨基酸合成以及大部分異丁醇是酵母通過糖代謝生成的觀點。同時，MA等[9]研究發現，敲除BAT2基因或過度表達BAT1基因都可以降低異丁醇含量，而敲除BAT2基因的同時過表達BAT1基因可以使異丁醇的含量進一步降低；Bap2p作為支鏈氨基酸滲透酶，與一般氨基酸滲透酶（由GAP1基因編碼）等一起負責氨基酸的攝取，不過它優先負責支鏈氨基酸的轉運。有研究發現，BAP2基因的缺失可使纈氨酸攝取量減少45%左右[10]，而纈氨酸又參與異丁醇的合成，所以BAP2基因的表達與異丁醇有一定關聯；乙酰乳酸合成酶（ILV2基因編碼）、乙酰羥酸還原酶（ILV5基因編碼）、二羥基酸脫水酶（ILV3基因編碼）是催化丙酮酸生成中間產物α-酮異戊酸（KIV）的關鍵酶，AVALOS等[11]研究表明，ILV基因的單獨過表達可使異丁醇的產量增加約5倍；由于異丁醇天然途徑中最后兩步反應在細胞質中進行，所以KIV在線粒體中合成后需運輸到胞漿后才能生成異丁醇。為了克服異丁醇合成過程中KIV跨膜運輸的障礙，Brat等[6]將纈氨酸生物合成酶基因ILV2、ILV5和ILV3由線粒體中重新定位到細胞質，在細胞質中形成了完整的異丁醇合成途徑從而提高異丁醇的產量。同時WESS等[12]也指明在細胞質中過表達纈氨酸合成途徑的乙酰乳酸合成酶（ILV2基因編碼）、乙酰羥酸還原酶（ILV5基因編碼）和二羥基酸脫水酶（ILV3基因編碼）3種內源性酶的同時阻斷線粒體纈氨酸合成的第一步，可使異丁醇產量增加22倍，達到0.22 g/L。

2.2 活性戊醇途徑及關鍵基因活性

Ehrlich途徑：異亮氨酸轉氨為α-酮-3-甲基戊酸，α-酮-α-甲基戊酸可以通過酮酸脫羧酶脫羧轉化為α-甲基丁醛后被還原成活性戊醇[13]。

Harris途徑：丙酮酸合成的α-酮丁酸在ILV基因的作用下生成α-酮-3-甲基戊酸，后經酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶作用生成活性戊醇。其中，中間產物α-酮丁酸由丙酮酸途徑、高絲氨酸途徑、蘇氨酸途徑3種途徑生成。

丙酮酸途徑：糖酵解而來的丙酮酸在異丙基蘋果酸合成酶（LEU1基因編碼）催化下生成β-蘋果酸甲酯，β-蘋果酸甲酯再轉化為α-酮丁酸。

蘇氨酸途徑：天冬氨酸經高絲氨酸生成蘇氨酸，蘇氨酸在ILV1（蘇氨酸脫氨酶）的作用下轉化成α-酮丁酸。

高絲氨酸合成途徑：此途徑目前尚未被研究明確，可能是高絲氨酸依次轉化為中間物質O-乙酰高絲氨酸、胱硫醚，最后形成最終產物α-酮丁酸[14]。據報道α-酮丁酸脫羧還原后可生成正丙醇[15]。

ILV基因、支鏈氨基酸轉氨酶基因（BAT1、BAT2）是活性戊醇合成途徑中的關鍵酶基因。同異丁醇途徑相似，活性戊醇的上游途徑也在線粒體中進行，其中間產物α-酮-3-甲基戊酸由ILV基因催化生成，有研究者發現，過度表達ILV基因可使活性戊醇的產生量與對照菌株相比略有增加[11]。

2.3 異戊醇途徑及關鍵基因

如圖3所示，異戊醇既可以通過Ehrlich途徑由亮氨酸分解而成，也可以經亮氨酸生物合成途徑產生。丙酮酸依次在乙酰乳酸合酶（ILV2基因編碼）、乙酰羥酸還原酶（ILV5基因編碼）、二羥基酸脫水酶（ILV3基因編碼）的作用下生成α-酮異戊酸，此部分在線粒體中進行，隨后經2-異丙基蘋果酸合酶（LEU4基因編碼）、異丙基蘋果酸異構酶（LEU1基因編碼）和2-異丙基蘋果酸脫氫酶（LEU2基因編碼）作用生成α-酮異己酸（α-ketoisocaproate，KIC）。最后，KIC（由 Ehrlich 途徑和亮氨酸從頭合成途徑而來）在α-酮酸脫羧酶（KDCs）和乙醇脫氫酶（ADHs）的催化下生成異戊醇。

啤酒酵母中異戊醇生成的上游途徑（丙酮酸到α-酮異己酸）由乙酰乳酸合成酶（ILV2基因編碼）、乙酰羥酸還原酶（ILV5基因編碼）、二羥基酸脫水酶（ILV3基因編碼）、2-異丙基蘋果酸合酶（LEU4或LEU9基因編碼）、異丙基蘋果酸異構酶（LEU1基因編碼）和2-異丙基蘋果酸脫氫酶（由LEU2基因編碼）共同作用；下游途徑（從KIC到異戊醇）由α-酮酸脫羧酶（KDCs）和乙醇脫氫酶（ADHs）催化。YUAN等[16]發現將亮氨酸生物合成途徑整合到酵母染色體上后異戊醇稍有提高，繼續過度表達OAC1（α-IPM轉運體）基因后異戊醇產量有了明顯的增強，這表明過表達OAC1基因可以使α-IPM更為有效地運出線粒體膜，從而提高異戊醇的產量。SUNG等[17]研究發現在釀酒酵母中敲除BAT1、BAT2這兩個基因并沒有導致異戊醇減少，并且在添加L-亮氨酸之前就能檢測到異戊醇，表明異戊醇主要是由糖代謝途徑生成的。ILV基因負責上游途徑中α-酮異戊酸的合成，它的表達將影響到異戊醇的產量。有研究者發現，在釀酒酵母中敲除ILV1基因后可使ILV2、ILV5及ILV3基因的表達水平顯著增加，加強了異戊醇生物合成的前體α-酮異戊酸的生物合成，從而引起異戊醇產量的增加，而酵母中LEU1或LEU2基因的敲除減少了α-酮異己酸的生物合成，所以降低了異戊醇的產量[18]。

2.4 苯乙醇途徑及關鍵基因

酵母可以利用芳香族氨基酸作為唯一的氮源，通過Ehrlich途徑合成2-苯乙醇（2-phenyl ethanol，2-PE），這是釀酒酵母合成2-PE的主要途徑，包括3個步驟。首先是L-苯丙氨酸（L-Phe）在兩種氨基酸轉氨同功酶（ARO8和ARO9基因編碼）的催化下轉化成苯丙酮酸，隨后苯丙酮酸在苯丙酮酸脫羧酶（ARO10基因編碼）催化下生成苯乙醛。最后苯乙醛還原為2-苯乙醇，5 種醇脫氫酶基因 ADH1、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5均能催化這一反應[19]。

苯丙酮酸脫羧酶（ARO10基因編碼）、氨基酸轉氨酶（ARO8和ARO9基因編碼）、鋅簇轉錄激活劑CAT8、DNA結合蛋白MIG1，鋅指轉錄激活子ARO80參與了2-苯乙醇的生物合成，其中，ARO80可以通過與ARO9和ARO10啟動子結合位點結合激活ARO9和ARO10基因的表達；LEE等[20]研究發現ARO80和GATA因子在ARO9、ARO10和ARO80基因表達中的相互作用；GATA轉錄因子Gln3p和Gat1p調控滲透酶基因和分解代謝酶基因的轉錄，它們不僅能促進底物有效進入細胞，還能通過直接激活ARO9和ARO10來增強芳香轉氨酶和苯丙酮酸脫羧酶的活性，因此GAT1與GLN3基因的過表達都可使2-PE合成得到顯著加強[21]；一般氨基酸滲透酶基因GAP1負責芳香族氨基酸轉運，過表達GAP1可促進底物L-Phe的轉運，提高2-PE的產量。CAT8和MIG1是與碳代謝相關的轉錄因子，WANG等[22]研究發現在敲除MIG1后CAT8表達與2-PE的含量都有了提升，這可能是MIG1參與了CAT8的轉錄調控，MIG1缺失促進CAT8的表達，CAT8的高效表達又上調了ARO9和ARO10基因的轉錄水平，進而增強了2-PE的產生。

2.5 高級醇合成下游途徑關鍵酶（KDCs與ADHs）

在釀酒酵母中，由糖代謝或氨基酸分解而來得α-酮酸需經α-酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶先后作用后才能生成高級醇。而釀酒酵母中有5種類似KDC的酶和6種乙醇脫氫酶（ADHs），通常分別由 PDC1、PDC5、PDC6、YDL080C/THI3、YDR380w/ARO10 與 ADH1、ADH2、ADH5、ADH6、ADH7、Sfa1 基因編碼。

丙酮酸是釀酒酵母中一個非常重要的化合物，一方面，它可以經丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶先后作用生成乙醇，另一方面，它也可以在一系列酶的作用下生成高級醇。丙酮酸脫羧酶（PDC1、PDC5、PDC6基因編碼）位于細胞質基質中，主要負責催化丙酮酸的脫羧，所以它們的表達可以決定丙酮酸的流向，進而影響高級醇的生成。ZHANG等[23]研究表明，單敲除PDC1、PDC5、PDC6基因均可提高異丁醇產量，原因是由于敲除PDC基因后，丙酮酸生成乙醇途徑受阻，迫使它流向高級醇代謝途徑，從而提高了異丁醇產量，敲除PDC6基因的菌株中乙醇含量降低也進一步驗證了這點。同時，LI等[24]研究發現PDC5基因的敲除是提高釀酒酵母異丁醇產量的主要因素之一，并且過表達ILV2和ARO10基因的同時敲除PDC5基因可導致異丁醇產量比對照菌株高8倍。李楊等[25]通過過表達ILV2、ILV3、BAT2基因的同時敲除PDC6基因將丙酮酸合成乙醇方向的代謝通量轉向合成異丁醇的方向上，使乙醇的產率降低，而異丁醇的產率提高了11.4倍。

類丙酮酸脫羧酶（YDL080C基因編碼）與苯丙酮酸脫羧酶（ARO10基因編碼）主要負責α-酮酸的脫羧，而此反應在各種高級醇生成中又稍有不同。有研究報道，在異戊醇合成過程中，α-酮異己酸脫羧主要由YDL080C、ARO10基因負責，在纈氨酸分解異戊醇的代謝中，丙酮酸脫羧酶（PDC1、PDC5、PDC6 基因編碼）中任意一種同工酶都可以將α-酮異戊酸脫羧成醛，而在活性戊醇的合成中，這5種酶中的任何一種都可以將α-酮-3-甲基戊酸脫羧[26]。苯丙酮酸脫羧酶（ARO10基因編碼）是一種具有廣泛底物特異性的脫羧酶，其活性依賴于酵母生在長過程中所使用的氮源[27]。當苯丙氨酸為唯一的氮源時，它的轉錄水平可增加30倍，且足以使苯丙酮酸脫羧[28]。

α-酮酸在脫羧成醛后還需經乙醇脫氫酶作用后才能生成高級醇，SHEN等[29]研究發現，與過表達ARO10基因相比，單獨過表達ADH基因對2-PE的產生沒有明顯的影響。然而，當ADH1、ADH2或ADH5基因與ARO10基因共同表達時可導致2-PE明顯增加。同時，KONDO等[30]也指出，當ADHs與來自乳球菌的脫羧酶KIVD在釀酒酵母中共表達時，ADH2和ADH5基因過表達可使異丁醇生產水平稍有增加、SFA1和ADH1基因過表達則對異丁醇的生產沒有影響、而ADH6和ADH7基因的過表達可使異丁醇顯著增加。

3 低產高級醇菌株的選育方法

啤酒酵母通常是由雜交而來的異源多倍體，不同品種的啤酒酵母由于其生理特性差異，即使采用相同發酵工藝，高級醇產量也大有不同。啤酒中高級醇含量普遍過高，想要將高級醇含量控制在合理范圍內，選育低產高級醇的優良酵母菌株是最根本的方法。目前，原生質體融合育種、誘變育種及基因工程育種是菌種選育最常用的方法。

3.1 原生質體融合育種

原生質體融合技術又稱細胞融合技術，是指兩種不同的親株用酶法去壁后，得到的原生質體置于高滲溶液中，在一定融合劑的促融作用下使兩者相互凝集并發生細胞之間的融合，進而導致基因重組獲得新菌株的育種方法[31]。蔡車國等[32]以發酵度較高的非絮凝性的啤酒酵母菌株和發酵度較低、絮凝性較強的啤酒酵母菌株為親本進行原生質體融合得到一株需酪素水解物的營養缺陷型菌株。該菌株經優化和原生質體融合后得到一株絮凝性較強且總高級醇含量顯著降低的優良菌株。王芬等[33]以紫外線滅活的菌株JW1-1（雙乙酰、總高級醇的含量較低，但發酵度較低）原生質體和熱滅活的菌株NW7-45（雙乙酰、總高級醇的含量較高，發酵度較高）原生質體為親本進行融合。經篩選得到了發酵度為69.5%，雙乙酰，乙醛和總高級醇的含量適中的優良菌株。

3.2 誘變育種

誘變是指采用物理、化學因素誘發機體發生遺傳性變異，并經過篩選，鑒定從而獲得新品種的方法。紫外誘變、微波誘變、室溫常壓等離子體（atmospheric room temperture plasma，ARTP）誘變育種是酵母常用的育種方法。SHEN等[34]利用紫外誘變技術，并經長期馴化后獲得了產高級醇與酯的比例低于對照菌株的突變株D-A-14。朱莉娜[35]等采用微波誘變技術對啤酒酵母進行誘變處理，經過乳酸培養基、酵母浸出粉胨葡萄糖-碳酸鈣培養基、氯化三苯基四氮唑顯色培養基等一系列鑒別培養基初篩后進行啤酒發酵復篩，得到7株高級醇產量降低的菌株。室溫常壓等離子體（ARTP）是一種新型全細胞誘變工具，其突變率高于紫外輻射或化學誘變劑，且處理溫度較低，非常適用于酵母菌株的誘變。王國正等[36]運用常溫常壓等離子體誘變技術篩選得到了一株高級醇產量降低20%的釀酒酵母菌株ARTP5，并且通過與原始菌株CF4胞內蛋白組差異相比，發現誘變菌株ARTP5的ADH1蛋白表達被下調，這可能是導致ARTP菌株產高級醇降低的原因之一。

3.3 基因工程育種

在過去的幾十年里，隨著分子學微生物的興起，基因工程的合理運用已經成為遺傳育種首選的方法。所謂的基因工程是指把某種生物的個別基因復制出來，經改造加工后放到另一個生物里面，定向的改變生物的遺傳性狀，從而獲得人們想要的物種的一種技術。為了探究BAT基因表達對酵母風味化合物影響，LILLY等[37]構建了BAT2/BAT1基因缺失突變株，結果發現任何一個基因的缺失都可以使異丁醇、異戊醇產量下降。石鈺等[38]運用同源重組技術構建了LEU1基因缺失的菌株，該菌株與出發菌株發酵試驗表明，突變株在降低異戊醇含量的同時提升了正丙醇和異丁醇的產量；ZHENG等[39]采用無痕敲除技術在BAT2基因位點過表達ALD6基因而構建了不含任何外源基因和外源 DNA 片段的菌株 （HJΔB-AG、HJΔB-AP 和HJΔB-AC），這些菌株產生的高級醇濃度分別降低了39.91%、45.55%和52.80%，且可以安全地應用于工業生產之中；同時，LI等[40]以I-SCEI內切酶為DNA雙鍵斷裂（DNA strand breaks，DSB）誘導劑，采用兩步整合技術構建了BAT2缺失和ATF1過表達的菌株。該突變株對高級醇的降低和酯的提高有明顯的效果。

4 結論與展望

20世紀初期已有研究者開始研究高級醇，經過100多年的研究，已經在碳源和氮源如何調控高級醇方面取得了不少進展，并且隨著基因工程的興起，高級醇在代謝通路，關鍵調控因子方面已愈發明朗，該文以啤酒酵母為研究對象，對其高級醇的合成途徑、關鍵調控基因（BAT2、BAT1、BAP2、ILV、LEU、PDC、ARO、ADH、YDL080C）及菌種選育手段進行重點描述，為適當的控制高級醇含量提供指導。

近年來人們主要從菌種的選育和發酵工藝兩方面對啤酒中高級醇進行控制，利用基因工程與誘變技術均可獲得低產高級醇的菌株，并且基因工程育種已實現了無痕改造，轉基因產品中已不包含任何外源基因和DNA片段，克服了不少安全隱患，未來有很好的應用前景，為此，還需繼續深入研究基因與代謝通路，使基因工程菌更加廣泛的運用于工業生產中。