UPLC-MS／MS法可同時測定化妝品中8種大環內酯類及林可胺類抗生素

王寧 章宦勝 隋玉杰 唐玉紅

目前的化妝品抽檢主要是以《化妝品安全技術規范》（2015版）為依據，其中僅提供了部分抗生素的檢測方法，如甲硝唑、氯霉素、鹽酸美滿霉素、二水土霉素、鹽酸四環素等，對于大環內酯類和林可胺類抗生素，檢測方法尚未涉及。作者選取了乳液和面霜類化妝品樣品，對化妝品中8種大環內酯類及林可胺類抗生素的檢測方法進行了系統性試驗，證明這種方法操作簡單、分離效率高、回收率穩定，可有效為化妝品中多種抗生素檢測提供技術支持，也可為化妝品中抗生素測定相關標準的制定奠定基礎。

抗生素由于其良好的抗菌作用和非特異性抗炎作用，在皮膚科治療中表現出較好的療效。一些化妝品生產者利用這類物質的治療特性，向化妝品（特別是祛痘類化妝品）中非法添加抗生素，以呈現又快又好的效果，而《化妝品安全技術規范》（2015版）將抗生素規定為禁用物質，原因在于抗生素長期使用可能造成耐藥性、菌群失調，甚至損害肝腎功能等后果。在近幾年國家藥品監督管理局對化妝品的抽查中發現，抗生素檢出頻頻出現，2018年初即公布了21批次祛痘化妝品的抗生素檢出情況。但是，目前的化妝品抽檢主要是以《化妝品安全技術規范》（2015版）為依據，其中僅提供了部分抗生素的檢測方法，如甲硝唑、氯霉素、鹽酸美滿霉素、二水土霉素、鹽酸四環素等，對于大環內酯類和林可胺類抗生素，檢測方法尚未涉及。而大環內酯類和林可胺類抗生素是皮膚科較為常用的兩類藥物：大環內酯類抗生素具有優良的抗炎作用，已被廣泛應用于銀屑病、痤瘡、玫瑰糠疹、酒渣鼻等皮膚病的治療中;林可胺類抗生素則被各大醫院用于制成治療痤瘡、皮膚分泌異常等疾病的制劑，療效顯著。一些化妝品中若添加了這兩類抗生素，則會因為沒有相應的檢測標準而躲避監管部門的檢查，因此有必要通過研究建立兩類抗生素的檢測方法標準。目前，已有少量文獻報道了對化妝品中部分林可胺類抗生素進行測定的方法，如克林霉素、林可霉素等，方法主要為液相色譜法和液相色譜一串聯質譜法。液相色譜一串聯質譜法因其高分離、高靈敏度、應用范圍廣、專屬性強等特點，在化妝品抗生素檢測方法研究方面應用越來越廣泛。本研究采用超高效液相色譜一串聯質譜法（UPIC-MSIMS）對化妝品中的紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素、羅紅霉素、林可霉素、克林霉素、吡利霉素、克林霉素磷酸酯同時進行測定。該方法的建立可為化妝品質量安全監控提供技術支持。

本文采用超高效液相色譜一串聯質譜法建立了對化妝品中8種大環內酯類及林可胺類抗生素（紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素、羅紅霉素、林可霉素、克林霉素、吡利霉素、克林霉素磷酸酯）同時進行測定的方法。樣品經乙腈渦旋分散、超聲、冰浴處理、離心、上清液稀釋過濾后進行UPLC-MS/MS儀器分析。8種抗生素在5-100 Ug/L范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.997，檢出限為1-20 Ug/kg。8種被測物質的平均加標回收率為80.0%～106.9%，精密度為0.6%-10.9%。該方法操作簡單高效、穩定性好，可用于化妝品中抗生素的快速測定。

一、測定儀器與試劑

1.主要試驗儀器

超高效液相色譜一串聯質譜儀（1290 Infinity11/6495，Agilent Technologies，Inc.）、渦旋振蕩器（VortexTM-1， WiggensGmbH）、超聲波發生器（P120H，ElmaSchmidbauer GmbH）、高速離心機（3K15，SigmaLaborzentrifugen GmbH）、 電子天平（CPA225D，Sarto rius G roup）。

2.主要試劑

紅霉素、克拉霉素標準品（Dr.Ehrenstorfer GmbH），阿奇霉素、羅紅霉素標準品（上海安譜實驗科技股份有限公司），林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯對照品（中國食品藥品檢定研究院），吡利霉素標準品（Toronto ResearchChemicals Inc.），甲醇、乙腈（色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司），甲酸（色譜純，北京百靈威科技有限公司）。

3.標準溶液配制

單組分標準儲備溶液：分別稱取適量的紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素、羅紅霉素、林可霉素、克林霉素、吡利霉素、克林霉素磷酸酯標準物質溶于甲醇中，配制成濃度為1000mg/L的單組分標準儲備溶液。

混合標準儲備溶液：分別吸取0.1 mL各單組分標準儲備溶液于IO mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成濃度為IO mg/L的混合標準儲備溶液。

混合標準中間溶液：吸取I.O mL混合標準儲備溶液于IO mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成濃度為l mg/L的混合標準中間溶液。

混合標準工作溶液：分別吸取5 UL、10 UL、20 UL、50uL、100 UL混合標準中間溶液，用空白樣品前處理所得基質溶液定容至1.0 mL，配制成5 Ug/L、10 Ug/L、20 ug/L、 50Ug/L、 100 Ug/L濃度系列混合標準工作溶液。

二、試驗方法

1.樣品前處理

稱取樣品Ig（精確至l mg）置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈后密閉，渦旋使之分散均勻，超聲提取10min。冰浴處理20 min，在5。C下以7000 r/min的轉速離心5 min，吸取500 UL上清液于5mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，所得稀釋液用0.22 um有機濾膜過濾凈化，移取適量凈化后溶液至進樣瓶中密封，供UPLC-MS/MS測定。

2.色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus Cl8 （3.0 mmXlOO mm，3.5 um）;進樣量：5 uL;流速：0.2 mL/min;柱溫：30℃;流動相：A：0 .1%甲酸水溶，B：乙腈;梯度洗脫程序見表L后運行時間為2 min。

3.質譜條件

離子源：電噴霧離子源;掃描方式：正離子掃描;監測模式：多反應監測（MRM）;毛細管電壓：4000 V;干燥氣溫度：200℃;干燥氣流速：II L/min;霧化器壓力：35 psi。各被測物質的多反應監測參數見表2，所得8種抗生素混合標準工作溶液的MRM譜圖如圖l所示。

三、結果與討論

1.線性范圍與檢出限

采用確定好的儀器方法，對按照標準溶液的配比步驟配制成的5 ug/L、10 u9/L、20 ug/L、50 ug/L、100 ug/L濃度系列混合標準工作溶液進行UPLC-MS/MS測定。以標液濃度為橫坐標、各被測物質色譜峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線，所得8種被測物質的標準曲線線性回歸方程見表3。由表3可以看出，8種被測抗生素在5-100 Ug/L濃度范圍內線性關系良好，線性相關系數均大于0.997。通過對空白樣品加入濃度逐漸降低的標液進行試驗測定的方法，并以信噪比3為條件確定檢出限，所得8種被測物質的檢出限見表3，為1-20 ug/kg。

2.回收率與精密度

采用乳液類和面霜類空白樣品進行加標回收試驗，添加水平為0.5 mg/kg、 2.5 mg/kg和5 mg/kg，每個樣品每個添加水平開展6次獨立重復試驗，所得平均回收率和精密度見表4，其中精密度以相對標準偏差（RSD）表示。從表4的結果來看，8種被測抗生素的平均回收率為80.0%-106.9%，精密度為0. 6%-10.9%。結果表明，該方法準確度較高，精密度良好。

3.實際樣品的檢測

通過網絡購買收集了20批次化妝品，主要為標稱具有祛痘、修護、敏感肌護理等功效的乳液和面霜類產品。用本研究方法對該20批次樣品進行8種大環內酯類及林可胺類抗生素測定，結果顯示：1批次面霜樣品有克林霉素磷酸酯檢出，l批次面霜樣品中有林可霉素檢出。

小結

本研究利用超高效液相色譜一串聯質譜法實現了對化妝品中8種大環內酯類及林可胺類抗生素的測定。本研究建立的試驗方法操作簡單，可在短時間內達到8種被測物質的有效分離，在5-100 ug/L濃度范圍表現出良好的線性，回收率穩定、準確高效。該方法可為化妝品中多種抗生素檢測提供技術支持，也可為化妝品中抗生素測定相關標準的制定奠定基礎。編后語

這篇論文看似專業，實際上不是為了試驗而試驗，而是著眼于實用，以消費者用妝安全和化妝品抽檢方法的完善為目的。言有限，而思無限。大眾消費者，無論是關注產品成分與功效的“成分黨”“功效黨”，還是緊跟消費潮流的消費者，通過這篇論文可以看到中國化妝品人在市場背后的思考與努力，提高對中國化妝品法規與監管等的信心。化妝品生產商、品牌商、經銷商等亦可收獲警醒之心，國家與業內專家一直致力于完善化妝品監管的法規、標準與方法，可鉆的空子越來越少，唯有合法合規方是正道。CCR

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