對葉百部標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC特征圖譜研究

林碧珊，高永堅(jiān)，陳錦霞，陳科成，張文芳

（國藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東順德528303）

對葉百部（Stemona tuberosaLour.）是《中國藥典》2020 年版百部Stemonae Radix 項(xiàng)下收載的3 種基原之一，具有潤肺下氣止咳、殺蟲滅虱之功，主要用于止咳祛痰平喘、抗寄生蟲、抗病原菌及殺蟲等[1]。對葉百部化學(xué)成分種類多，主要有蛋白質(zhì)、氨基酸、香豆素、內(nèi)酯、多肽、糖、苷類、多糖、生物堿、有機(jī)酸、酚類等化學(xué)成分[2-3]。目前，文獻(xiàn)報(bào)道主要通過原植物形態(tài)、藥材性狀、顯微性狀、生物堿種類及含量的不同進(jìn)而鑒別百部3種基原[4-5]。

飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)、臨床應(yīng)用為基礎(chǔ)，參考現(xiàn)代提取方法，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎劑[6]。中藥配方顆粒的各項(xiàng)指標(biāo)及生產(chǎn)過程必須與標(biāo)準(zhǔn)湯劑確定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相吻合[7-8]。關(guān)于百部的基原研究，樊蘭蘭[9]研究了百部地下不同部位的HPLC指紋圖譜，且比較了3種不同基原百部的指紋圖譜；鐘瑩[10]建立了對葉百部的HPLC 指紋圖譜，并對比了3 種不同基原百部的HPLC 指紋圖譜。本研究采用UPLC 法建立對葉百部標(biāo)準(zhǔn)湯劑的特征圖譜，不僅可以為百部配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供一定的參考依據(jù)，同時(shí)可以用于不同基原及劣質(zhì)品的對葉百部藥材鑒別，還可用于對葉百部的質(zhì)量控制，為其質(zhì)量評價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

H-class UPLC 高效液相色譜儀（PDA 二極管陣列檢測器，美國Waters公司）；AL104電子天平（梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE 數(shù)控超聲清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）；M MILLIPORE Synergy UV 超純水儀（美國默克公司）。

1.2 試藥

綠原酸對照品（批號：140709-201404）、對葉百部對照藥材（批號：121221-201604）、直立百部對照藥材（批號：121588-201502）由中國食品藥品檢定研究院提供；隱綠原酸對照品（批號：DST170210-035）、新綠源酸對照品（批號：DST180130-015）由成都德思特生物技術(shù)有限公司提供；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.3 樣品

21 批對葉百部藥材分別從湖北、湖南、四川、云南等不同產(chǎn)地購得，經(jīng)國藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司質(zhì)管部黃國滿助理工程師按照《中國藥典》2020 年版對葉百部藥材檢驗(yàn)15 批符合規(guī)定，6 批不符合規(guī)定。藥材及相關(guān)樣品具體信息見表1和表2。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

取S1-S15 批對葉百部飲片100 g，置5 L 電控溫煎藥壺中，加水煎煮兩次。第一次煎煮加9倍量水，浸泡30 min 后，先武火煮沸后再文火保持微沸煎煮30 min，用350 目篩網(wǎng)趁熱過濾，濾液迅速用水冷卻。第二次煎煮加7 倍量水，先武火煮沸后再文火保持微沸煎煮25 min，用350 目篩網(wǎng)趁熱過濾，濾液迅速用水冷卻，合并兩次濾液。將合并后的濾液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮（水浴溫度：48 ℃，真空度：-0.1 MPa），濃縮至約200 g 左右，測定含固率，加入純化水至清膏含固率為15%，分裝至10 mL 西林瓶中，每瓶分裝體積為2.5 mL，分裝完畢后轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥機(jī)中凍干，取出，軋鋁蓋，即得凍干粉。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性

色譜柱為CORTECS T3 柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)；乙腈為流動相A，0.1%磷酸為流動相B，梯度洗脫（0～10 min，1%→22%A；10～15 min，22%→50%A；15～18 min，50%→90%A；18～20 min，90%A；20～20.1 min，90%→1%A；20.1～23 min，1%A）；柱溫為25 ℃；流速為0.25 mL/min；檢測波長為210 nm；進(jìn)樣量1 μL；理論塔板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于10 000。

表1 15批符合規(guī)定的對葉百部樣品信息表Table 1 Sample information of 15 batches of compliant Stemona tuberosa Lour

表2 6批不符合規(guī)定的對葉百部樣品信息表Table 2 Sample information of 6 batches of non-compliant Stemona tuberosa Lour

2.3 參照物溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 取綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸對照品適量，精密稱定，分別加80%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇制成每1 mL含20 μg的對照品溶液；

2.3.2 對照藥材溶液的制備 取對葉百部對照藥材0.5 g，精密稱定，置20 mL 量瓶中，加入80%甲醇適量，超聲處理（500 W，40 kHz）30 min，取出，放冷，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm 濾膜濾過，即得對葉百部對照藥材溶液。

2.4 供試品溶液的制備

取百部標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉適量，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加入80%甲醇適量，超聲（500 W，40 kHz）處理10 min，取出，放冷，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm濾膜濾過，即得。

2.5 特征圖譜方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取對葉百部標(biāo)準(zhǔn)湯劑1 份，按“2.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，以綠原酸為參照峰，計(jì)算各峰與參照峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積。各色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD 均小于3.5%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取對葉百部標(biāo)準(zhǔn)湯劑1 份，按“2.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)色譜條件分別在0、2、4、8、12、16、20、24 h 進(jìn)樣檢測，以綠原酸為參照峰，計(jì)算各峰與參照峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積。各色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD 均小于3.0%，表明供試品液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批對葉百部標(biāo)準(zhǔn)湯劑，分別精密稱取6 份，按“2.4”項(xiàng)的方法平行制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，以綠原酸為參照峰，計(jì)算各峰與參照峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積。各色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD均小于1.0%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.6 特征圖譜的建立與分析

2.6.1 特征峰指認(rèn) 分別吸取“2.3.1”項(xiàng)對照品溶液和“2.4”項(xiàng)供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖1。將供試品色譜峰與對照品色譜峰保留時(shí)間進(jìn)行比較，確定供試品圖譜中的3 號峰為綠原酸，1號峰為新綠原酸，4號峰為隱綠原酸。

2.6.2 特征圖譜的建立 取S1-S15符合規(guī)定的對葉百部飲片，按“2.1”項(xiàng)制備15 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品，按“2.4”項(xiàng)制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)的色譜條件測定，記錄15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑色譜圖。采用國家藥典委員會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”對15 批對葉百部標(biāo)準(zhǔn)湯圖譜進(jìn)行分析，選擇8 個(gè)分離度較好的共有色譜峰為特征峰。通過與對葉百部對照藥材色譜圖進(jìn)行對比，確定峰1為新綠原酸、峰3為綠原酸、峰4為隱綠原酸，結(jié)果見圖2～圖4。

2.6.3 共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的測定根據(jù)《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》[11]，以綠原酸峰3 為參照峰（S 峰），計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間和各相對峰面積，結(jié)果見表3～表4。

圖1 新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸對照與對葉百部標(biāo)準(zhǔn)湯劑圖譜Figure 1 Chromatograms of Neochlorogenic acid,Chlorogenic acid, Cryptochlorogenic acid and standard decoction of Stemona tuberose Lour

圖2 15批對葉百部標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC疊加圖譜Figure 2 UPLC superimposed chromatograms of 15 batches of standard decoction for Stemona tuberosa Lour

圖3 對葉百部對照藥材UPLC圖譜Figure 5 UPLC chromatogram of the control medicinal material of Stemona tuberosa Lour

圖4 對葉百部標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC對照圖譜Figure 4 UPLC comparison chromatogram of standard decoction for Stemona tuberosa Lour

2.6.4 不同產(chǎn)地標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜相似度分析 將15 批樣品的UPLC 特征圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012 版）”，以S1 圖譜為參照圖譜，時(shí)間窗設(shè)置為0.1，進(jìn)行峰匹配，計(jì)算得到15 批對葉百部標(biāo)準(zhǔn)湯劑與對照圖譜之間的相似度，結(jié)果見表5。可見，15 批對葉百部標(biāo)準(zhǔn)湯劑的相似度分別為0.974、0.993、0.998、0.975、0.926、0.977、0.905、0.984、0.977、0.969、0.973、0.992、0.968、0.981、0.972，均大于0.9，表明不同產(chǎn)地的對葉百部藥材具有較高的相似性。

2.7 特征圖譜的應(yīng)用

2.7.1 不同基原百部的鑒別 本文所建立的特征圖譜，其特征峰的相對保留時(shí)間具有特征性，結(jié)果見圖5，能區(qū)分不同基原百部，為百部藥材的質(zhì)量控制提供參考方法。

2.7.2 對葉百部劣質(zhì)品的鑒別 取“1.3”項(xiàng)的S16-S21等6批不符合規(guī)定的對葉百部藥材，采用本研究方法與對葉百部對照藥材進(jìn)行特征峰的對比，結(jié)果見圖6。可見，6批藥材的特征峰與對葉百部對照藥材特征峰比均少了2 個(gè)特征峰（峰6 和峰7），經(jīng)過鑒定確定為S16-S18 及S20 為走油，S19 為部分走油，S21 為霉敗，表明通過本研究方法可以進(jìn)行對葉百部藥材劣質(zhì)品的鑒定。

3 討論

考察了檢測波長（210、230、250、270 nm）、流動相系統(tǒng)（乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%甲酸溶液）及柱溫（25、30、35 ℃）的分離效果，結(jié)果以檢測波長為210 nm、流動相系統(tǒng)為乙腈-0.1%磷酸及柱溫為35 ℃時(shí)的分離效果較好。

比較提取溶劑（水、50%甲醇、80%甲醇、甲醇、乙醇）、提取方式（超聲提取、回流提取）及提取時(shí)間（10、20、30 min）的提取效果，結(jié)果以提取溶劑為80%甲醇、提取方式為超聲提取及提取時(shí)間為30 min時(shí)的提取效果較好。

表3 15批對葉百部標(biāo)準(zhǔn)湯劑的相對保留時(shí)間Table 3 Relative retention time of 15 batches of standard decoction for Stemona tuberosa Lour(n=15)

表5 15批對葉百部標(biāo)準(zhǔn)湯劑的相似度測定結(jié)果Table 5 The similarity results of 15 batches of standard decoction for Stemona tuberosa Lour

圖5 對葉百部與直立百部對照藥材UPLC圖譜的對比圖Figure 5 Comparison of UPLC chromatograms of the control medicinal material of Stemona tuberosa Lour and Stemona sessilifolia

圖6 6 批不符合規(guī)定的對葉百部與對葉百部對照藥材UPLC圖譜的對比圖Figure 6 Comparison of UPLC chromatograms of 6 batches of Stemona tuberosa Lour samples that do not meet the requirements and Stemona tuberosa Lour contral

本研究對15 批對葉百部標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品進(jìn)行相似度評價(jià)計(jì)算，結(jié)果表明15批對葉百部標(biāo)準(zhǔn)湯劑的相似度均大于0.9，表明不同產(chǎn)地的對葉百部飲片具有較高的相似性，產(chǎn)地差異較少。選擇峰3 綠原峰作為S峰，測定共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果表明各共有峰保留時(shí)間穩(wěn)定，相對峰面積比值差別較大，表明不同產(chǎn)地對葉百部飲片的質(zhì)量存在一定差異。

在中藥材品種的發(fā)展變遷中，不僅存在多基原品種現(xiàn)象，導(dǎo)致藥材品種混亂、質(zhì)量難以控制，同時(shí)也存在劣質(zhì)品摻雜的現(xiàn)象，不同程度地影響著藥材質(zhì)量的安全性、有效性和可控性。本研究初步建立的方法可應(yīng)用于不同基原及劣質(zhì)品的對葉百部藥材的鑒別，為對葉百部藥材提供更全面的質(zhì)量控制方法。