曲咪新乳膏的有關物質研究

古麗霞，廖志剛，鄧紅，2，林華慶，梁勇坤，余良鐘，張蜀，2，賴昌威

（1.廣東藥科大學廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣東廣州510006；2.廣東藥科大學廣東省局部精準藥物遞藥制劑工程技術研究中心，廣東廣州510006；3.廣東華潤順峰藥業有限公司，廣東佛山528300）

曲咪新乳膏為外用復方制劑，曾用名為皮康霜，每克乳膏中含有1 mg醋酸曲安奈德、10 mg硝酸咪康唑、3 000 U 硫酸新霉素；臨床上主要用于過敏性皮炎、濕疹、失禁相關性皮炎、體癬、股癬以及手足癬等病癥治療[1-4]。

曲咪新乳膏現行標準有《國家藥品標準》化學藥品地標升國標第二冊、1996 年版北京市藥品標準及企業內控標準，現有標準未對有關物質作出要求，主要針對醋酸曲安奈德鑒別和含量測定作了規定：以氯化三苯四氮唑為顯色劑，紫外-可見光分光光度計測定其含量[5-6]。該方法穩定性差，前處理繁瑣，檢測結果受環境影響，且無法測定主藥的有關物質[7-8]。

目前，曲咪新乳膏質量研究主要集中在3 種主藥的含量測定，已有文獻報道采用固相萃取-HPLC法、管碟法、HPLC-ELSE 法同時測定1 種或者2 種主藥含量[9-11]。梁秋霞等[12]簡述了曲咪新乳膏3種主藥的有關物質和含量測定方法，其側重點在于對大量企業抽檢樣品進行測定，評估市場上曲咪新乳膏總體質量。本研究系統篩選了有關物質供試品溶液的制備方法，通過強制降解試驗優化了色譜條件，并探討曲咪新乳膏主藥的降解途徑，所建立的UHPLC-PDA 法和溶劑萃取-高速離心-HPLC-ELSE法能有效檢測出乳膏的有關物質，為本品質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

AcQuity 超高效液相色譜儀（配制PDA 檢測器，美國Waters 公司）；2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；2420 型ELSD 檢測器（美國Waters 公司）；色譜柱為Thermo scientific AccucoreaQ C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；TGL-20B高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；BSA224S-CW 分析天平、CP225D 分析天平（德國賽多利斯公司）。

曲咪新乳膏（廣東華潤順峰藥業有限公司，批號：20151111、20151112、20151113、20160601、20160602、20160603、20161201、20161202、20161203、20170301、20170302、20170303、20170601、20170602、20170603、20170808、20170810、20170812、20171201、20171202、20171203；A 企業，批號：160203、170403；B 企業，批號：B1058；C 企業，批號：170304；D 企業，批號：20170908；E 企業，批號：170904）；原料藥：醋酸曲安奈德（天津天藥藥業股份有限公司，批號：NTAC170701；質量分數98.5%），硝酸咪康唑（廣州市漢普醫藥有限公司，批號：20170301；質量分數：100.5%），硫酸新霉素（宜昌三峽制藥有限公司，批號：201708034，每1 mg 的效價為667 個單位，水分：4.5%）；對照品：曲安奈德（批號：100055-201103，質量分數：98.8%），新霉胺（批號：130411-200908）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈、四氫呋喃為色譜純；其他試劑為分析純；水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 曲安奈德及其他有關物質

2.1.1 溶液配制 供試品溶液：取本品約2.5 g（約相當于醋酸曲安奈德2.5 mg、硝酸咪康25 mg），精密稱定，置10 mL 量瓶中，加入甲醇-四氫呋喃（體積比1∶1，下同）適量，在80 ℃水浴分散2 min，放冷至室溫，加甲醇-四氫呋喃稀釋至刻度，輕搖勻，冰浴2 h，取出迅速經微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

對照品溶液：取曲安奈德對照品約12.5 mg，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加甲醇-四氫呋喃振搖溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取該溶液與供試品溶液各l mL，置同一100 mL 量瓶中，用甲醇-四氫呋喃稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 色譜條件與系統適用性 AcQuity 超高效液相色譜儀（配制PDA檢測器，美國Waters公司）；色譜柱為Thermo scientific AccucoreaQ C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動相A 為甲醇-乙腈-1%乙酸銨（體積比23∶23∶54），流動相B 為甲醇-乙腈-1%乙酸銨（體積比40∶40∶20），采用梯度洗脫（0～8 min，100%A；8～16 min，100%A→0%A；16～26 min，0%A；26～28 min，0%A→100%A）；流速：0.5 mL/min；檢測波長：235 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。取“2.1.1”項供試品溶液與對照品溶液依法進樣，記錄色譜圖見圖1，可見曲安奈德峰與醋酸曲安奈德峰的分離度應大于10.0。

圖1 醋酸曲安奈德、硝酸咪康唑對照品溶液（A）與供試品溶液（B）色譜圖Figure 1 Chromatograms of triamcinolone acetonide acetate,miconazole nitratesystem control solution (A) and test solution(B)

2.1.3 強制降解實驗 取曲咪新乳膏（順峰，批號：20170808；A 企業，批號：160203）、缺醋酸曲安奈德陰性乳膏（自制）、缺硝酸咪康唑陰性乳膏（自制）、全空白乳膏各2.5 g，醋酸曲安奈德原料藥2.5 mg，硝酸咪康唑原料藥25 mg分別置10 mL量瓶；按下列方法處理后，加甲醇-四氫呋喃適量，80 ℃水浴分散2 min，放冷，加混合溶劑稀釋至刻度，冰浴2 h，搖勻，濾過，即得。

（1）酸強制降解試驗：加6 mol/L HCl溶液1 mL，放置10 h，加6 mol/L NaOH溶液1 mL。

（2）堿強制降解試驗：加6 mol/L NaOH 溶液1 mL，放置30 min，加6 mol/L HCl溶液1 mL。

（3）氧化強制降解試驗：加30%H2O2溶液1 mL，放置72 h。

（4）高溫強制降解試驗：烘箱110 ℃放置24 h，放至室溫。

（5）光照強制降解試驗：采用光照試驗儀（4 500 lx）照144 h。

分別取上述未破壞和各強制降解后溶液，按“2.1.2”項色譜條件進樣，記錄色譜圖，結果見圖2。

可見，曲咪新乳膏降解前可檢測出有關物質曲安奈德；各降解條件下，較明顯的降解產物均為曲安奈德。乳膏在堿性條件下較不穩定，除曲安奈德外，同時產生1 個醋酸曲安奈德降解產物（峰2）和1個硝酸咪康唑降解產物（峰4）；氧化降解陰性乳膏（自制）和供試品乳膏均檢測出峰13，推測為輔料降解產物。各主藥與降解產物峰歸屬見表1。

圖2 醋酸曲安奈德和硝酸咪康唑樣品溶液強制降解試驗色譜圖Figure 2 Forced degradation test chromatograms of sample solutions of triamcinolone acetonide acetate and miconazole nitrate

表1 主藥與降解產物峰歸屬Table 1 Peak assignment of main drug and degradation products

2.1.4 溶液穩定性 取“2.1.1”項供試品溶液和對照品溶液，于室溫自然光下放置0、1、2、4、6、8 h 后取出，進樣測定，供試品溶液可檢出曲安奈德，峰面積RSD 為2.16%，未見新雜質產生；對照品溶液曲安奈德、醋酸曲安奈德、硝酸咪康唑峰面積RSD 為2.34%、2.87%、3.39%，表明供試品溶液和對照品溶液在8 h內穩定。

2.1.5 檢測限 取“2.1.1”項對照品溶液，逐級稀釋，進樣測定，按信噪比為3∶1計算檢測限，曲安奈德的檢測限為0.24 μg/mL、醋酸曲安奈德為0.42 μg/mL、硝酸咪康唑為3.54 μg/mL。

2.1.6 有關物質樣品測定 取本品，依法測定，記錄色譜圖，結果曲安奈德為最大單個雜質，按外標法以峰面積計算均不超過1.0%；樣品中歸屬硝酸咪康唑的相關雜質，均未超過對照溶液主峰面積0.5%；總雜質均不超過對照溶液主峰面積1.5%。

2.2 硫酸新霉素有關物質新霉胺

2.2.1 溶液配制 供試品溶液：取本品適量（約相當于硫酸新霉素7.5 mg），精密稱定，置25 mL 離心管中，加入三氯甲烷0.5 mL，強力振搖使溶解，離心30 min（10 000 r/min），分取水層置于5 mL量瓶中；再加水約1 mL 于離心管，振搖萃取，離心30 min（10 000 r/min），分取水層，重復以上操作3 次，合并水層于5 mL 量瓶，用水稀釋至刻度，即得供試品溶液（每1 mL溶液含新霉素1.5 mg）。

新霉胺對照品溶液：取新霉胺對照品約15 mg，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，作為新霉胺對照品儲備液（0.3 mg/mL）。精密量取上述對照品儲備液1 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，作為新霉胺對照品溶液（30 μg/mL）。

系統適用性溶液：取硫酸新霉素原料藥適量（約相當于新霉素15 mg），精密稱定，置10 mL 量瓶中，再精密加入上述對照品儲備液1 mL，加水稀釋至刻度，配制硫酸新霉素和新霉胺混合對照品溶液作為系統適用性溶液。

2.2.2 色譜條件與系統適用性 2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司），2420 型ELSD 檢測器（美國Waters 公司）；色譜柱為Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-含0.7%五氟丙酸的20 mmol/L 乙酸銨溶液（體積比55∶45）；流速：1 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃；霧化溫度：60 ℃；漂移管溫度：70 ℃；載氣壓力：206.85 kPa；撞擊器：關；增益值：10。取“2.2.1”項混合對照品溶液，依法進樣，記錄色譜圖見圖3，可見新霉素峰保留時間約為8 min。

圖3 新霉素系統適用性溶液（A）與供試品溶液（B）色譜圖Figure 3 Chromatograms of neomycin system suitability solution(A)and sample solution(B)

2.2.3 強制降解試驗 取曲咪新乳膏（順峰，批號：20170812；A 企業，批號：170403）、缺硫酸新霉素陰性乳膏（自制）、全空白乳膏各2 g，硫酸新霉素原料藥7.5 mg，分別置25 mL 離心管，加入0.5 mL 三氯甲烷，振搖使溶解，按下列方法處理。

（1）酸強制降解試驗：加入2 mol/L HCl 溶液1 mL，超聲振搖1 h，放置過夜，加入1 mL 2 mol/L NaOH 溶液，加水約1 mL，振搖，離心30 min（10 000 r/min），取水層于5 mL量瓶并稀釋至刻度。

（2）堿強制降解試驗：加入2 mol/L NaOH 溶液1 mL，超聲振搖1 h，加入1 mL 2 mol/L HCl 溶液，加水約1 mL，振搖，離心30 min（10 000 r/min），取水層于5 mL量瓶并稀釋至刻度。

（3）氧化強制降解試驗：加入三氯甲烷0.5 mL，振搖使溶解，加入1 mL 30% H2O2溶液，超聲振搖1 h，按“2.2.1”項供試品溶液自“加水約1 mL…”制備。

（4）高溫強制降解試驗：加入三氯甲烷0.5 mL，振搖使溶解，沸水浴1 h，放冷并補足失重，按“2.2.1”項供試品溶液自“加水約1 mL…”制備。

（5）光照強制降解試驗：加入三氯甲烷0.5 mL，置光照試驗儀（4 500 lx）于2 h，放冷并補足失重，按“2.2.1”項供試品溶液自“加水約1 mL…”制備。

分別取上述未破壞和各強制降解后溶液，按“2.2.2”項色譜條件進樣，記錄色譜圖，結果見圖4。可見，曲咪新乳膏降解前新霉胺均符合限量要求；各降解途徑新霉胺均無明顯增加。

2.2.4 加標回收率 精密稱取曲咪新乳膏（批號：20170810）約2.5 g 于25 mL 離心管中，加入“2.2.1”項下的新霉胺對照溶液0.5 mL，自加入“三氯甲烷0.5 mL”起，按“2.2.1”項供試品溶液的制備方法制備加標樣品（6份），計算加標樣品的回收率為100.9%，RSD為1.99%。

2.2.5 溶液穩定性 由于供試品未檢出新霉胺，故采用加標樣品進行溶液穩定性試驗：取“2.2.4”項下的一份加標樣品，室溫放置，于0、1、2、4、6、8 h 測定，記錄新霉胺的峰面積，計算RSD 為3.43%，表明溶液在8 h內基本穩定。

2.2.6 檢測限 精密稱取新霉胺對照品適量，逐級稀釋，進樣測定，按信噪比為3∶1 計算檢測限，新霉胺檢測限為6 μg/mL，即在供試品溶液濃度為1.5 mg/mL，含0.4%的新霉胺即被檢出，滿足ChP2020 硫酸新霉素中新霉胺的限度為2.0%的要求。

2.2.7 有關物質樣品測定 按“2.2.2”項下色譜條件，注入色譜儀，記錄色譜圖，代表性圖譜見圖3，結果均無檢出新霉胺。

3 討論

3.1 曲安奈德及其他有關物質

3.1.1 供試品溶液制備溶劑和方法的考察 醋酸曲安奈德在三氯甲烷中溶解，硝酸咪康唑略溶于甲醇。根據乳膏和主藥的溶解性，參考文獻[13-15]，本研究對甲醇、異丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、四氫呋喃及其兩兩組合進行篩選，結果顯示三氯甲烷-甲醇（體積比1∶9）和甲醇-四氫呋喃（體積比1∶1）可分散曲咪新乳膏且容易濾過，使用其他溶劑出現渾濁或者分層，或無法過濾；進一步比較2 種混合溶劑，結果顯示甲醇-四氫呋喃（體積比1∶1）溶解快且完全，因此選擇甲醇-四氫呋喃（體積比1∶1）作為乳膏中醋酸曲安奈德和硝酸咪康唑的有關物質測定供試品溶液制備的溶劑。參考2020 年版《中國藥典》（ChP2020）中醋酸曲安奈德乳膏含量測定項下供試品溶液的制備方法“置80 ℃水浴中加熱2 min”，考察了醋酸曲安奈德和硝酸咪康唑的回收率分別為99.87%、102.09%，且未產生明顯降解產物，說明80 ℃水浴不影響有關物質測定。

圖4 硫酸新霉素樣品溶液強制降解試驗液相色譜圖Figure 4 Forced degradation test chromatograms of neomycin sulfate sample solutions

3.1.2 色譜條件的選擇 參考文獻及各國藥典，醋酸曲安奈德的流動相系統均采用甲醇-水或乙腈-水；硝酸咪康唑的流動相系統均采用甲醇-乙腈-乙酸銨[16]。經試驗，甲醇-水或乙腈-水系統（不加乙酸銨）硝酸咪康唑無法出峰，因此，擬采用甲醇-乙腈-乙酸銨系統，同時測定乳膏中醋酸曲安奈德和硝酸咪康唑的有關物質。

ChP2020 中醋酸曲安奈德檢測波長為240 nm，硝酸咪康唑為230 nm，BP2018咪康唑乳膏為235 nm，USP42～NF37 硝酸咪康唑乳膏為225 nm[17-19]。采用二極管陣列檢測器進行掃描，發現波長為235 nm 時基線較平穩，可同時檢測230 nm（硝酸咪康唑）和240 nm（醋酸曲安奈德）的有關物質，并可在兩者之間獲得相對平衡的響應值，因此選擇檢測波長為235 nm。

3.1.3 強制降解試驗 本研究曾選擇較溫和的條件進行破壞，本品穩定，逐步加劇破壞條件至有明顯的降解產物。強制降解試驗顯示，乳膏在堿性條件下較不穩定，加堿30 min 即需終止試驗，并產生較多降解產物。高溫強制降解試驗曾嘗試加入溶劑甲醇-四氫呋喃，沸水浴加熱破壞，結果溶劑很快揮干，且乳膏制劑經處理后無法濾過；后采用將樣品直接放入烘箱110 ℃、24 h，結果原料藥穩定，制劑中曲安奈德峰增大，其中缺硝酸咪康唑陰性乳膏醋酸曲安奈德幾乎完全降解為曲安奈德。原因可能是乳膏為半固體制劑，原料藥為固體，固體狀態下物質較為穩定。成品制劑比抽離硝酸咪康唑陰性乳膏穩定，說明處方工藝的合理性。

3.1.4 有關物質限度 ChP2020 中醋酸曲安奈德原料藥曲安奈德的限量為1.0%，總雜質限度為2.5%；硝酸咪康唑原料藥總雜質限度為0.5%。經強制降解試驗和對多批樣品的檢測，本品主要降解產物為曲安奈德，暫定本品曲安奈德的限量為1.0%，其他最大單個雜質不得超過1.0%，總雜質不得超過3.0%。由于乳膏處方使用了較多輔料，且采用了梯度洗脫的色譜條件，有關物質的檢查和計算需排除輔料峰和溶劑峰。

3.2 硫酸新霉素有關物質新霉胺

3.2.1 供試品溶液制備方法的考察 乳膏屬半固體制劑，分油水兩相，前期研究直接加水超聲或加入溫水后溫水浴，體系呈乳濁狀，無法過濾，因此先加入三氯甲烷強力振搖使油、水相分離，后以水洗滌油相使提取完全，硫酸新霉素在水中極易溶解，離心分離后合并水層為供試品溶液。

3.2.2 色譜條件的選擇 各國藥典中硫酸新霉素主要采用薄層色譜法檢查新霉胺的限量。本研究曾參考ChP2020、BP2018[18]和李曉鑫[20]的薄層色譜條件進行檢測，結果顯示供試品溶液斑點過載明顯，新霉胺斑點顯色時容易化開，重現性差。參考戴向東[21]HPLC-ELSE 法，在此基礎上優化色譜條件，發現乙酸銨降至20 mmol/L 時，新霉素的保留時間略增加；五氟丙酸降至0.7%時，新霉素的保留時間不變，優化后的色譜條件離子對試劑和緩沖鹽用量更少。

3.2.3 強制降解條件的選擇 新霉素在酸、堿和高溫試驗中均明顯降解，但新霉胺仍未超過限度，說明新霉胺并非其主要降解產物，在原料藥控制限度即可。新霉素主要成分為新霉素A（新霉胺）、新霉素B、新霉素C，其中新霉素C 效價約為新霉素B 的二分之一，因此EP9.0 和BP2018 中還規定了新霉素C 峰面積應為新霉素B 的3%～15%[22]；查閱資料可知新霉素還含有巴龍霉胺、巴龍霉素Ⅰ和Ⅱ、新霉素的單-N-乙酰基衍生物（neomycin LP-A、LP-B 和LP-C）等有關物質[23-24]，有待進一步研究。

4 總結

本研究收集了市售5個其他企業生產的曲咪新乳膏，從性狀、離心穩定性及有關物質3 個方面比較，選擇了質量最優的A 企業產品作為對照藥品同時進行強制降解試驗，建立了UHPLC-PDA 法和高速離心-HPLC-ELSE 法測定曲咪新乳膏的有關物質，結果表明方法專屬性強，靈敏度高，可有效分離曲咪新乳膏3 種主藥的有關物質，為本品質量控制提供參考。